Про удосконалення організації дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами

{Із змінами, внесеними згідно з Наказом Міністерства
охорони здоров'я
№ 38/а від 15.01.2014}

Відповідно до абзацу другого статті 6 Закону України "Про захист населення від інфекційних хвороб" та пункту 9 Положення про Міністерство охорони здоров'я України, затвердженого Указом Президента України від 13 квітня 2011 року № 467, з метою подальшого удосконалення організації дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами НАКАЗУЮ:

1. Затвердити:

1.1. Методичні рекомендації щодо організації дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами (далі - Методичні рекомендації), що додаються.

1.2. Склад робочої групи Міністерства охорони здоров'я України супроводу дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами, що додається.

1.3. Примірний перелік лікувально-профілактичних закладів (далі - ЛПЗ), на базі яких проводиться дозорний епідеміологічний нагляд за бактеріальними менінгітами, що додається.

{Підпункт 1.3 пункту 1 в редакції Наказу Міністерства охорони здоров'я № 38/а від 15.01.2014}

1.4. Примірне положення про Центральну референс-лабораторію з інвазивних бактеріальних захворювань, що додається.

2. Покласти функції Центральної референс-лабораторії з інвазивних бактеріальних захворювань на бактеріологічну лабораторію ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України".

3. Голові Державної санітарно-епідеміологічної служби України (А. Пономаренко) прийняти цей наказ до керівництва та застосування під час здійснення державного санітарно-епідеміологічного нагляду.

4. Керівникам структурних підрозділів з питань охорони здоров'я Донецької та Хмельницької обласних, Київської міської державних адміністрацій спільно з територіальними органами та установами Держсанепідслужби України у Донецькій, Хмельницькій областях та м. Києві:

4.1. Затвердити склад робочих груп супроводу дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами, визначити відповідальних осіб та надіслати копії відповідних наказів до ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України".

{Підпункт 4.2 пункту 4 виключено на підставі Наказу Міністерства охорони здоров'я № 38/а від 15.01.2014}

4.2. Організувати виконання та забезпечити контроль за повнотою обліку випадків захворювань на бактеріальні менінгіти дітей до 5 років, виконанням комплексу лікувально-діагностичних, профілактичних та протиепідемічних заходів для здійснення дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами.

4.3. Організувати збір, зберігання та передачу зразків ліквору, культур, виділених з ліквору та крові дітей хворих та з підозрою на бактеріальні менінгіти, до лабораторних центрів Держсанепідслужби України у Донецькій, Хмельницькій областях та м. Києві для наступної щомісячної доставки до ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України" відповідно до Методичних рекомендацій, затверджених цим наказом.

4.4. Забезпечити раціональне цільове використання медичних виробів та діагностичних препаратів, отриманих у вигляді технічної допомоги від Всесвітньої організації охорони здоров'я (ВООЗ).

5. Головному лікарю ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України" (Л. Некрасова) забезпечити:

5.1. Виконання бактеріологічною лабораторією ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України" функцій Центральної референс-лабораторії з інвазивних бактеріальних захворювань відповідно до положення та Методичних рекомендацій, затверджених цим наказом.

5.2. Узагальнення звітів з дозорних регіонів щодо захворюваності на бактеріальні менінгіти, результатів лабораторної діагностики та подання звітів до МОЗ України та ВООЗ.

5.3. Проведення молекулярно-генетичних досліджень зразків ліквору, серологічне типування штамів збудників бактеріальних менінгітів, отриманих з дозорних регіонів.

5.4. Передачу зразків ліквору та виділених культур збудників до Регіональної референс-лабораторії Європейського регіонального бюро ВООЗ в Україні з інвазивних бактеріальних захворювань (Московський національно-дослідний інститут епідеміології та мікробіології ім. Г.Н. Габричевського, Москва, Російська Федерація) для поглибленого вивчення.

5.5. Участь в раундах міжнародного контролю якості.

5.6. Контроль за якістю здійснення комплексу заходів щодо проведення дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами в дозорних регіонах шляхом їх відвідування (за підтримки ВООЗ).

5.7. Надання організаційно-методичної допомоги дозорним лікувально-профілактичним закладам та лабораторним центрам Держсанепідслужби України у Донецькій, Хмельницькій областях та м. Києві у здійсненні комплексу заходів щодо проведення дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами.

5.8. Визначення потреби, замовлення та отримання витратних матеріалів для діагностики бактеріальних менінгітів, передачу їх дозорним лікувально-профілактичним закладам відповідно до переліку ЛПЗ, затвердженого цим наказом.

6. Вважати таким, що втратив чинність, наказ МОЗ України від 02.04.2007 № 159 "Про порядок організації дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами та рентгенологічно підтвердженими пневмоніями в період впровадження імунізації проти Xib-інфекції".

7. Департаменту реформ та розвитку медичної допомоги (М. Хобзей) відповідно до покладених завдань та функцій у межах компетенції здійснювати моніторинг за дотриманням Методичних рекомендацій закладами охорони здоров'я.

8. Контроль за виконанням цього наказу покласти на першого заступника Міністра О. Качура.

МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
щодо організації дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами

1. Загальні положення

1.1. Ці Методичні рекомендації розроблені відповідно до Закону України "Про захист населення від інфекційних хвороб" та згідно з Положенням про Міністерство охорони здоров'я України, затвердженого Указом Президента України від 13 квітня 2011 року № 467.

Перелік умовних скорочень

ВООЗ - Всесвітня організація охорони здоров'я

БМ - бактеріальні менінгіти

ДНК - дезоксирібонуклеінова кислота

КА - кров'яний агар

КДЛ - клінічно-діагностична лабораторія

ЛА - лабораторний аналіз

ЛПЗ - лікувально-профілактичні заклади

ЛЦ - лабораторні центри Держсанепідслужби України

МОЗ - Міністерство охорони здоров'я України

ПЛР - полімеразна-ланцюгова реакція

РРЛ - Регіональна Референс-лабораторія Європейського регіонального Бюро Всесвітньої організації охорони здоров'я в Україні з інвазивних бактеріальних захворювань

СМР - спинномозкова рідина

ТІ-середовище - транс-ізоляційне середовище

ША - "шоколадний" агар

ЦРЛ - Центральна референс-лабораторія з інвазивних бактеріальних захворювань ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України"

ЦТА - цистин-триптиназний агар

McF - стандарт каламутності Мак Фарланда.

1.2. Метою дозорного епідеміологічного нагляду за БМ є оцінка ефективності комплексу профілактичних, протиепідемічних та лікувально-діагностичних заходів, спрямованих на зниження захворюваності БМ дитячого населення визначених регіонів для подальшої екстраполяції цих даних на все дитяче населення України.

1.3. Діти віком до 5 років з підозрою на менінгіт, які звернулися за медичною допомогою до амбулаторно-поліклінічної мережі, служби швидкої допомоги, інших закладів охорони здоров'я, госпіталізуються у спеціалізований інфекційний стаціонар з клініко-діагностичною лабораторією відповідного ЛПЗ, який входить до Примірного переліку ЛПЗ, визначеного цим наказом (далі - дозорний стаціонар) відповідно до Протоколів діагностики та лікування інфекційних хвороб у дітей, затверджених наказом від 9 липня 2004 року № 354 "Про затвердження Протоколів діагностики та лікування інфекційних хвороб у дітей".

{Пункт 1.3 розділу 1 в редакції Наказу Міністерства охорони здоров'я № 38/а від 15.01.2014}

1.4. Для ефективного проведення дозорного епідеміологічного нагляду і отримання найбільш повної інформації для аналізу та прийняття рішень необхідна чітка взаємодія спеціалістів різного профілю - епідеміологів, інфекціоністів, реаніматологів, педіатрів, імунологів, бактеріологів.

2. Критерії включення в систему дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами

2.1. В систему дозорного епіднагляду включаються всі пацієнти молодше 5 років, у яких підозрюється менінгіт (визначення випадку представлено нижче), і які госпіталізовані (або будуть госпіталізовані) в стаціонарне відділення (інфекційний стаціонар або відділення реанімації та інтенсивної терапії).

Визначення вікових категорій:

молодше 5 років - дитина, яка ще не досягла 5-го року народження; ця категорія включає дітей у віці до 59 місяців і 29 днів (діти у віці 60 місяців в систему дозорного епіднагляду не включаються).

2.2. Клінічні критерії

- загальноінфекційний синдром;

- менінгеальний синдром.

Менінгеальний синдром включає:

- гідроцефально-гіпертензійні симптоми: різкий головний біль дифузного характеру, повторна блювота, загальна гіперестезія;

- менінгеальні симптоми: менінгеальна поза, тонічне напруження м'язів спини, ригідність м'язів потилиці, позитивні симптоми Керніга і Брудзинського (верхній, середній, нижній);

- у дітей раннього віку - вибухання (рідко втягнення) і напруження тім'ячка, позитивний симптом Лесажа, закидання голови назад.

2.3. Лабораторні критерії постановки діагнозу

В лабораторній діагностиці менінгіту використовують наступні методи:

Культуральний: виділення бактеріального патогена зі стерильної в нормі СМР або крові.

Серологічний: визначення антигену в стерильній у нормі СМР за допомогою латексаглютинації, імунохроматографічного дослідження.

Бактеріоскопічний: мікроскопія мазка нативного ліквору, пофарбованого за Грамом.

Молекулярно-генетичний: виявлення у лікворі специфічних фрагментів ДНК збудника бактеріального менінгіту.

2.4. Класифікація випадків

2.4.1. Підозрюваний випадок. Будь-яка дитина у віці до 5 років, що поступає в дозорний стаціонар з ознаками раптового підвищення температури (>38,5 °C ректально або 38 °C в пахвовій западині) і з наступними симптомами в анамнезі: ригідність потиличних м'язів, сплутана свідомість або інші менінгеальні ознаки або кожна дитина до 5 років, госпіталізована з клінічним діагнозом "менінгіт".

2.4.2. Вірогідний випадок. Підозрюваний випадок, як описано вище, у якого за результатами дослідження СМР виявлений, принаймні, один з наступних показників при дослідженні ліквору:

каламутність або непрозорість;

лейкоцитоз (> 100 кл/мм3);

лейкоцитоз (10 - 99 кл/мм3) і підвищений рівень білка (>100 мг/дл) або знижений рівень глюкози (< 40 мг/дл).

2.4.3. Підтверджений випадок. Це випадок підозри на менінгіт, підтверджений лабораторно: бактеріологічно - виділенням бактеріальної культури збудника або іншими методами: бактеріоскопічно (дослідження мазка, пофарбованого за Грамом), виявленням відповідних бактеріальних антигенів в імунохроматографічному тесті "Binax NOW Streptococcus pneumoniae Test" (далі - тест "Binax"), в реакції латексаглютинації (далі - ЛА) або бактеріальних ДНК в ПЛР (Haemophilus influenzae серотипу b, Streptococcus pneumoniae або Neisseria meningitis) в зразках матеріалу від дитини з клінічними проявами, характерними для БМ.

3. Організація дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами

Дозорний епідеміологічний нагляд за БМ включає збір інформації щодо захворюваності дітей до 5 років, аналіз отриманої інформації і розробку на цій основі планів профілактичних і протиепідемічних заходів.

3.1. Порядок забезпечення дозорного епідеміологічного нагляду за БМ в дозорному стаціонарі.

3.1.1. Виявлення дітей, хворих на БМ та з підозрою на нього, встановлення діагнозу відповідно до клінічного визначення випадку захворювання на БМ, а також забезпечення реєстрації випадків захворювання здійснюється відповідним ЛПЗ.

{Підпункт 3.1.1 пункту 3.1 розділу 3 в редакції Наказу Міністерства охорони здоров'я № 38/а від 15.01.2014}

3.1.2. В кожному дозорному стаціонарі має бути розроблений і затверджений головним лікарем алгоритм виявлення, обліку, лабораторного обстеження дітей, які включаються в систему дозорного епіднагляду відповідно до критеріїв визначених в пунктах 2.2 та 2.3 цих Методичних рекомендацій (включаючи дії персоналу у вихідні, святкові дні та позаробочий час).

3.1.3. На кожний виявлений випадок захворювання на менінгіт у дітей віком до 5 років, при підозрі на це захворювання, а також у разі зміни діагнозу медичні працівники дозорного стаціонару направляють протягом 12 годин екстрене повідомлення про інфекційне захворювання за формою № 058/о, затвердженою наказом МОЗ України від 10 січня 2006 року № 1 "Про затвердження Форм первинної облікової документації з інфекційної, дерматовенерологічної, онкологічної захворюваності та інструкцій щодо їх заповнення", зареєстрованого в Міністерстві юстиції України від 8 червня 2006 року за № 686/12560 (зі змінами та доповненнями), з використанням доступних засобів зв'язку (телефону телефон/факс, інтернет).

{Підпункт 3.1.3 пункту 3.1  розділу 3 в редакції Наказу Міністерства охорони здоров'я № 38/а від 15.01.2014}

3.1.4. Кожен випадок захворювання на менінгіт у дітей віком до 5 років підлягає реєстрації та обліку за місцем його виявлення у формі № 060/о "Журнал обліку інфекційних захворювань", затвердженою наказом МОЗ України від 10 січня 2006 року № 1 "Про затвердження Форм первинної облікової документації з інфекційної, дерматовенерологічної, онкологічної захворюваності та інструкцій щодо їх заповнення", зареєстрованого в Міністерстві юстиції України від 08 червня 2006 року за № 686/12560 (зі змінами та доповненнями).

{Підпункт 3.1.4 пункту 3.1 розділу 3 в редакції Наказу Міністерства охорони здоров'я № 38/а від 15.01.2014}

3.1.5. Клінічні зразки (СМР та кров) для лабораторного дослідження повинні бути відібрані до початку антимікробної терапії або, якщо антибактеріальна терапія вже проводиться, перед повторним (черговим) введенням антибіотика і невідкладно доставлені до лабораторії у придатному для проведення лабораторних досліджень стані.

Із спинномозкового каналу, лікар за допомогою люмбальної (міжхребетної) пункції стерильно, дотримуючись правил асептики, відбирає СМР в день госпіталізації хворого у 3 стерильні пробірки (по 1 мл мінімум; при можливості, по 3 - 4 мл): пробірка № 1 для цитологічних та біохімічних (визначення білка та глюкози) досліджень; пробірка № 2 для бактеріологічних досліджень, тесту "Binax" та ЛА, пробірка № 3 (кріопробірка або Епендорф) - для дослідження методом ПЛР.

3.1.6. Відповідальний лікар - інфекціоніст дитячий дозорного стаціонару готує і вносить первинні дані на кожний підозрюваний, вірогідний та підтверджений випадок БМ до бланку "Заключного донесення", який передають до головних управлінь Донецького та Хмельницького обласних, Київського міського територіальних органів Держсанепідслужби України.

Форма "Заключного донесення" заповнюється на усі підозрілі, вірогідні та підтверджені випадки захворювання на менінгіт серед дітей віком до 5 років (незалежно від заключного діагнозу).

3.1.7. Лабораторії дозорних стаціонарів:

- з матеріалу у пробірці № 1 підраховують цитоз та роблять біохімічні дослідження ліквору; з пробірки № 2 - бактеріоскопію мазка пофарбованого за Грамом та первинний посів осаду СМР на поживні середовища, супернатант використовують для ЛА; пробірку № 3 заморожують та зберігають у морозильній камері. Про отримані результати інформують відповідального лікаря. Більш детально ці процедури описані в розділі 4 цих Методичних рекомендацій;

- передають у стислі терміни, з дотриманням вимог біологічної безпеки усі зразки СМР (включаючи залишки СМР, що залишилися від досліджень в КДЛ - окрема кріопробірка), виділені культури, у супроводі "Паспорта штаму" (додаток 3 до цих Методичних рекомендацій) та направлення, до ДУ "Донецький обласний лабораторний центр Держсанепідслужби України" та ДУ "Хмельницький обласний лабораторний центр Держсанепідслужби України, ДУ "Київський міський лабораторний центр Держсанепідслужби України для подальшої передачі в ЦРЛ;

- забезпечують стаціонар стерильним лабораторним посудом та необхідними поживними середовищами;

- систематично беруть участь в раундах зовнішнього контролю якості мікробіологічних досліджень на бактеріальні менінгіти. Терміни проведення раундів зовнішнього контролю визначає ЦРЛ;

- беруть участь в раундах професійного тестування (міжнародний контроль якості досліджень), що організує та проводить ВООЗ.

{Пункт 3.2 розділу 3 виключено на підставі Наказу Міністерства охорони здоров'я № 38/а від 15.01.2014}

3.2. Завдання ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України" та ЦРЛ щодо забезпечення дозорного епідеміологічного нагляду за БМ в дозорних регіонах.

3.2.1. Координація діяльності Донецької та Хмельницької обласних, Київської міської робочих груп щодо проведення дозорного епіднагляду за БМ.

3.2.2. Митне очищення, отримання та розподіл діагностичних препаратів, медичних виробів, отриманих як технічна допомога від ВООЗ.

3.2.3. Організація та проведення необхідних тренінгів для лікарів-бактеріологів КДЛ дозорних стаціонарів та ЛЦ.

3.2.4. Отримання інформації щодо випадків менінгітів, аналіз, внесення її в електронну базу даних. Щомісячна передача електронної бази даних до ВООЗ відповідно до наданої програми.

3.2.5. Узагальнення отриманої інформації і інформування МОЗ до 25 числа першого наступного за звітним кварталом місяця.

3.2.6. Впровадження в практичну діяльність закладів та установ, залучених в систему дозорного епіднагляду за БМ, рекомендації ВООЗ.

3.2.7. Забезпечення лабораторного супроводу системи дозорного епіднагляду:

- підтримання та видача лабораторіям дозорних регіонів референс-штамів для контролю якості поживних середовищ та постановки діагностичних тестів;

- підтвердження та типування виділених культур збудників БМ, а за необхідності, або/при виникненні труднощів на місцях - проведення ідентифікації збудників захворювання;

- визначення чутливості виділених культур - збудників БМ до антибіотиків;

- ведення банку зразків СМР;

- тестування СМР за допомогою ПЛР, при необхідності, проведення усього комплексу досліджень з метою визначення етіологічного чинника БМ;

- передача зразків СМР та виділених культур збудників БМ до РРЛ;

- участь у системі Міжнародного контролю якості досліджень;

- організація та проведення зовнішнього контролю якості досліджень (готує та надає контрольні "імітаційні" задачі бактеріологічним лабораторіям ЛЦ та дозорних стаціонарів);

- участь в нарадах та тренінгах лабораторної мережі ВООЗ по дозорному епіднагляду за інвазивними бактеріальними захворюваннями в установленому порядку.

4. Порядок проведення лабораторної діагностики бактеріальних менінгітів

4.1. Забір і обробка матеріалу для дослідження

Основним біологічним матеріалом для лабораторних досліджень при БМ служать СМР і кров. Загальні вимоги до забору матеріалу надані у п. 3.2.3 цих Методичних рекомендацій.

При заборі і посіві досліджуваного матеріалу слід дотримуватись наступних вимог:

- виключити випадкову контамінацію матеріалу сторонньою мікрофлорою (правильний забір матеріалу, точний доступ до осередку інфекції, дотримання правил асептики);

- не допустити загибелі збудника з моменту забору матеріалу і до початку роботи з ним в лабораторії (доставка зразків або посівів в лабораторію негайно в теплому вигляді або тимчасове зберігання у відповідних умовах).

4.1.1. Спинномозкова рідина. Забір СМР проводять через голку для люмбальної пункції в 3 стерильні пробірки. В кожну з пробірок бажано зібрати 1 - 2 мл СМР (при можливості, по 3 - 4 мл). Для проведення всього комплексу лабораторних досліджень загальний об'єм відібраної СМР має складати не менше 3 мл. У випадку якщо, це неможливо технічно, має бути відібрано не менше 1 мл.

Пробірка № 1 має бути відправлена в клінічну лабораторію для біохімічного та цитологічного аналізу. СМР, що залишилася після проведення досліджень, необхідно зберегти та передати в бактеріологічну лабораторію для подальшого дослідження за допомогою тесту "Binax" та ЛА;

Пробірка № 2 - (стерильна, центрифужна, сумісна з центрифугою, якою користуються в лабораторії) має бути відправлена в бактеріологічну лабораторію для бактеріоскопії, бактеріологічного дослідження, тесту "Binax" та ЛА;

Пробірка № 3 - (кріопробірка або Епендорф) - має бути направлена для дослідження методом ПЛР в ЦРЛ). СМР, що залишилася після проведення досліджень в ЦРЛ, використовується для тесту "Binax" та ЛА (при необхідності) та для подальших досліджень в РРЛ.

При недостатній кількості СМР пріоритет має віддаватися мікробіологічному дослідженню, зокрема:

якщо доступні тільки 2 пробірки, вміст однієї має бути використаний для визначення глюкози, білка і цитологічного аналізу (залишок СМР передати до бактеріологічної лабораторії для подальших досліджень), а інша для бактеріоскопії, тесту "Binax", ЛА, бактеріологічного посіву та ПЛР;

якщо доступна тільки одна пробірка, то бажано, щоб вона поступила в бактеріологічну лабораторію для проведення бактеріоскопії, тесту "Binax", ЛА, бактеріологічного посіву та передачі в ЦРЛ для проведення ПЛР.

4.1.2. Кров. Кров для бактеріологічного дослідження відбирають з вени під час надходження хворого в стаціонар з дотриманням правил асептики і до початку антибіотикотерапії в кількості 2,0 - 4,0 мл - у дітей і 1,0 - 2,0 мл - у новонароджених і одразу засівають у флакони для гемокультур безпосередньо у відділенні.

Необхідно звертати увагу на те, що об'єм зразка, поміщений у флакон не повинен перевищувати 4-х мл.

Флакони для гемокультур перед використанням переглядають на предмет пошкоджень і дефектів, а також перевіряють їх термін придатності.

Не рекомендується міняти голки між венопункцією і посівом на середовище для гемокультур, а також надягати ковпачки на голки після використання, оскільки в цьому випадку існує високий ризик травми.

4.2. Зберігання та доставка матеріалу для досліджень

4.2.1. СМР. Зразок СМР для бактеріологічного дослідження має бути відправлений до бактеріологічної лабораторії та посіяний на відповідні поживні середовища протягом першої години після забору. Матеріал доставляють в спеціальних транспортних контейнерах, здатних підтримувати температуру (36 ± 1) °C. Роботу з матеріалом починають відразу після його надходження в лабораторію.

Зразки СМР, призначені для бактеріологічного дослідження, не повинні поміщатися в холодильник.

При неможливості швидкої доставки СМР з стаціонару в лабораторію (нічний час, вихідні і святкові дні тощо) рекомендується наступний порядок дій.

Посіяти СМР у кількості 0,5 - 1,0 мл у флакон з TI-середовищем. Флакон з середовищем дістають із холодильника, як мінімум, за 30 хвилин до посіву СМР. Для забезпечення оптимальних умов для росту мікроорганізмів середовище має бути прогріто до кімнатної температури (допускається використання термостату). До внесення матеріалу у флакон з середовищем його перевіряють візуально на наявність видимих ознак проросту або каламутності. За наявності ознак проросту або каламутності утилізують флакон з середовищем, оскільки воно може бути контамінованим.

Вказати на флаконі дату, П.І.Б. пацієнта і іншу необхідну інформацію.

Підняти стерильним пінцетом середню частину металевого ковпачка флакона. Продезінфікувати кришку 70% спиртом і дати висохнути (30 - 60 сек.). За допомогою стерильного шприца набрати 0,5 - 1,0 мл СМР з пробірки № 2 і внести у флакон, проткнувши голкою гумову пробку. Після посіву, перевернути флакон з TI-середовищем кілька разів для перемішування.

Якщо доставка в лабораторію затримується (до наступного дня або більше), вставити через гумову пробку флакона з ТІ-середовищем вентиляційну голку (стерильна голка для підшкірних ін'єкцій закрита стерильною ватою). Голка не повинна бути занурена в рідку фазу.

Зберігати флакони з посівами у вертикальному положенні при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 до відправки в лабораторію.

Посіви не повинні піддаватися дії прямого сонячного світла, зайвого нагріву і пилу. Перед транспортуванням в лабораторію видалити вентиляційні голки для запобігання витіканню рідкої фази і контамінації зразків під час транспортування і протерти гумову пробку 70% спиртом.

Якщо флакони з ТІ-середовищем можуть бути доставлені в лабораторію того ж дня, їх не вентилюють.

Зразки СМР для ПЛР необхідно по можливості швидко заморожувати при температурі -70 °C. За відсутності морозильної камери, що підтримує температуру -70 °C, використовують морозильну камеру на -20 °C. До заморожування зразки зберігають при температурі 2 - 8 °C в умовах холодильника не більше доби, враховуючи, що інформативність результатів ПЛР буде зворотно пропорційна часу затримки перед заморожуванням.

4.2.2. Кров. При неможливості негайно відправити флакони з гемокультурою в лабораторію їх зберігають в термостаті температурі 25 °C, при відсутності термостата - в умовах кімнатної температури до моменту відправки. Посіви не повинні поміщатися в холодильник.

4.3. Методи мікробіологічних досліджень

Лабораторії дозорних стаціонарів повинні використовувати наступні методи мікробіологічного дослідження: бактеріоскопія СМР, бактеріологічний посів СМР та крові, видова ідентифікація отриманих ізолятів, тест "Binax" та ЛА з СМР та виділеними штамами збудників, визначення чутливості їх до антибактеріальних препаратів.

В залежності від кількості СМР, що надійшла на дослідження, лікар-бактеріолог має визначити пріоритетність методів, з урахуванням наступного.

Якщо в пробірці, що надійшла до бактеріологічної лабораторії, міститься більше 1 мл СМР, то необхідно:

Струсити пробірку з СМР.

Відібрати в кріопробірку 0,5 мл СМР і заморозити для проведення ПЛР в ЦРЛ.

СМР, що залишилася, центрифугувати при 1200 g 5 - 10 хв. Осад, що утворився, використати для бактеріологічного посіву, приготування мазка для бактеріоскопії, а супернатант - для проведення тесту "Binax" та ЛА (при негативному результаті тесту "Binax").

Якщо в бактеріологічну лабораторію поступило менше 1 мл СМР, то:

Пробу не потрібно центрифугувати.

Струсити пробірку.

Приготувати мазок для бактеріоскопії, пофарбувати за Грамом, зробити посів на чашки з КА і ША.

СМР, що залишилася, у тому числі після досліджень в клінічній лабораторії, використовують для проведення тесту "Binax" та ЛА (при негативному результаті тесту "Binax") і направлення до ЦРЛ.

У всіх випадках бактеріологічний посів СМР здійснюють перед проведенням тесту "Binax", оскільки тампони, які використовуються в цьому тесті, не є стерильними, тому результати бактеріологічного дослідження СМР після занурення в неї тампона "Binax" можуть виявитися некоректними.

4.3.1. Бактеріоскопія мазка нативного ліквору

Приготування мазку з нативного ліквору. Фарбування за Грамом.

1. Провести центрифугування СМР при 1000 g 10 - 15 хв., якщо об'єм доступного для дослідження матеріалу > 1 мл.

2. Підготувати мазок шляхом нанесення 1 - 2 крапель ретельно перемішаного осаду СМР на предметне скло так, щоб крапля(і) утворила(и) одну велику пляму мутнуватої, однорідної суспензії. При цьому мають використовуватися нові предметні стекла.

3. Висушити мазок природним шляхом на повітрі.

4. Для фіксації пронести мазок 2 - 3 рази через полум'я пальника (не допускати перегріву предметного скла, оскільки це може зумовити значне спотворення істинної картини або руйнування клітин).

5. Залити мазок розчином кристалічного фіолетового (через фільтрувальний папір) і залишити на 1 хвилину.

6. Зняти фільтрувальний папір. Залити мазок розчином Люголя і залишити на 1 хвилину.

7. Знебарвити 96% етиловим спиртом протягом 5 - 10 сек., поки не перестануть відходити цівки фарби.

8. Ополоснути мазок дистильованою водою.

9. Провести контрастне фарбування сафраніном протягом 20 - 30 сек. або карболовим фуксином - 10 - 15 сек.

10. Промити мазок водою і висушити за допомогою фільтрувального паперу.

11. Провести бактеріоскопію мазка (в світлі що проходить з використанням масляної імерсії). Перегляд мазка проводять ретельно, переглядаючи як мінімум 20 полів зору, або до того часу, поки бактерії не будуть виявлені. Пряма мікроскопія дозволяє встановити наявність бактерій, що викликали захворювання.

N.meningitidis можуть розташовуватись поза клітиною або всередині лейкоцитів, за Грамом забарвлюються негативно, виглядають як диплококи схожі на зернини кави.

H.influenzae в мазках - дрібні грамнегативні кокобактерії або палички, схильні до поліморфізму, оточені ледь помітною ніжною капсулою, розташовані у вигляді коротких ланцюжків або ниток.

S.pneumoniae мають вигляд ланцетовидних диплококів та коротких ланцюжків, утворюють капсулу; вони грампозитивні, добре фарбуються усіма аніліновими барвниками, при цьому капсула залишається безбарвною і помітна тільки на забарвленому фоні.

Опис морфології інших бактерій викладений у відповідних нормативних документах.

Результат бактеріоскопії ліквору негайно сповіщають в стаціонар.

4.3.2. Бактеріологічне дослідження

Культивування посівів при первинному виділенні збудників менінгіту з СМР, крові та отриманні чистої культури має проводитися в атмосфері, що містить 5 - 10% CO2. З цією метою використовують CO2-термостати, анаеростати, спеціальні ємності, що герметично закриваються (типу GENbox) з газогенераторними пакетами. При їх відсутності для створення підвищеної концентрації CO2 можна використовувати будь-який посуд з притертою кришкою, наприклад, ексикатор із свічкою. Чашки з посівами розміщують в середині судини догори дном, там же закріплюють запалену свічку висотою 2 - 3 см та накривають кришкою. До моменту затухання свічки створюється підвищена концентрація CO2 (7 - 10%).

Бактеріологічний посів спинномозкової рідини.

Посів СМР на чашки з ША та КА бажано зробити безпосередньо "біля ліжка хворого" в стаціонарі після проведення пункції.

Чашки з поживними середовищами так само як і все приладдя необхідне для забору патологічного матеріалу, в достатній кількості повинні зберігатися в профільному відділенні стаціонару або їх негайно (при необхідності) доставляють з бактеріологічної лабораторії. Середовища зберігають в умовах холодильника (+4 °C). Перед пункцією поживні середовища дістають з холодильника і прогрівають в термостаті при 37 °C не менше 30 хв.

Після проведення пункції безпосередньо з пункційної голки виконують посів СМР на чашки з ША та КА. Чашку обережно відкривають і на поверхню середовища капають 3 - 4 краплі СМР. Чашку закривають, ставлять на рівну поверхню і за допомогою декількох кругових рухів чашки по поверхні столу розподіляють краплі СМР по поверхні агару. Після того, як СМР вбереться (звичайно 2 - 3 хвилини) необхідно зафіксувати дно і кришку чашки (наприклад пластиром) для того, щоб не виникло її випадкового відкриття.

Якщо посів СМР "біля ліжка хворого" не зроблено, його проводять в бактеріологічній лабораторії. Для цього стерильною пластиковою бактеріологічною петлею збирають невелику кількість СМР з осаду, що утворився після центрифугування або з пробірки, призначеної для бактеріологічних досліджень і проводять посів штрихом на заздалегідь прогріті в термостаті чашки з ША та КА.

Посіви інкубують при температурі (36 ± 1) °C протягом 24 - 48 годин в атмосфері CO2. За наявності росту на щільних поживних середовищах проводять візуальну оцінку колоній, що виросли, готують мазок, фарбують за Грамом, мікроскопують, визначають наявність оксидази, каталази і, залежно від отриманого результату, проводять подальшу ідентифікацію збудника і визначення чутливості до антибіотиків.

При надходженні до лабораторії посіву на TI-середовищі лабораторне дослідження проводять згідно наступної схеми:

A. При надходженні флаконів з ТІ-середовищем в день посіву:

Вставити в них вентиляційні голки та інкубувати при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2.

Через 18 - 24 години інкубації очистити кришку флакона з посівом на TI-середовищі тампоном, змоченим спиртом, і при необхідності пропалити над полум'ям пальника. Стерильними шприцами з голками перенести 50 - 100 мкл рідкої частини TI-середовища на чашки з КА та ША;.

Інкубувати чашки з посівами при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 протягом 24 годин.

Посіви на TI-середовищі (з вентиляційною голкою) продовжувати інкубувати при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 до 7 діб.

Якщо через 24 години відсутній ріст на чашках з ША і КА відсутній, то дослідження проводять наступним чином:

Очистити кришку флакона з TI середовищем тампоном, просоченим спиртом, добре струсити флакон, щоб перемішати вміст і відібрати всю рідку фазу (бульйон), в стерильний одноразовий шприц.

Розлити бульйон в одну або декілька стерильних пробірок і центрифугувати при 3000 об/хв. протягом 10 хв.

Відібрати супернатант і дослідити його в реакції латексаглютинації. Супернатант, що залишився, заморозити для передачі в ЦРЛ.

Приготувати з частини осаду мазок і пофарбувати його за Грамом.

Осад, що залишився, посіяти штрихом на ША та КА. Інкубувати посіви в атмосфері CO2 при 37 °C 48 годин. Переглянути чашки на предмет росту через 24 години.

Якщо ріст на чашках відсутній, видалити алюмінієву кришку і гумову пробку флакона з середовищем TI. Зібрати стерильним тампоном матеріал з поверхні скошеного агару і посіяти його на ША та КА, інкубувати посіви в умовах, вказаних вище.

При наявності росту провести ідентифікацію виділених культур та визначення їх чутливості до антибактеріальних препаратів.

B. При надходженні флаконів з ТІ-середовищем в лабораторію з вентиляційними голками після 24 - 48 год. інкубації у відділенні, стерильними шприцами з голками, перенести 50 - 100 мкл рідкої частини TI-середовища на чашки з КА та ША. Далі дослідження проводити як вказано в пункті A.

На будь-якому етапі лабораторного дослідження, при необхідності, можуть додатково використовуватися поживні середовища, для виявлення інших збудників бактеріальних менінгітів відповідно наказу МОЗ України від 15.04.2005 № 170 "Про затвердження методичних вказівок з мікробіологічної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів".

Бактеріологічний посів крові. Для вирощування посівів крові використовується автоматичний аналізатор гемокультур (наприклад BacT/ALERT і ін.). Посів здійснюють за рекомендаціям виробника щодо правильного використання аналізатора і поживних середовищ.

Проміжок часу між забором зразка і початком інкубації посіву повинен бути мінімальний, це дозволяє уникнути можливого негативного впливу на певні мікроорганізми наприклад S.pneumoniae.

Інкубація посівів крові. Посіви, що надійшли з відділень, помістити в автоматичний аналізатор гемокультур відповідно до інструкції виробника приладу. попередньо перевіривши їх на наявність ознак пошкоджень. Пошкоджені флакони не повинні поміщатися в аналізатор.

Посіви інкубують при (36 ± 1) °C до 5 діб.

Бактеріоскопія і висів. Після надходження сигналу про те, що у флаконі спостерігається ріст мікроорганізмів, його необхідно дістати з аналізатору, продезінфікувати гумову пробку спиртом і дати висохнути. Стерильним шприцом з голкою відібрати декілька крапель суміші рідкої фази з кров'ю. Посіяти штрихом по 1 краплі на чашки з ША та КА. Нанести 1 краплю на предметне скло для фарбування за Грамом. Негайно повідомити про результати бактеріоскопії лікуючого лікаря.

Інкубувати посіви на щільних середовищах при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 протягом 18 - 24 год.

Провести ідентифікацію отриманих культур згідно стандартним схемам. Провести визначення чутливості до антибактеріальних препаратів.

Всі культури, виділені із зразків крові, включаючи можливі контамінанти, повинні бути ідентифіковані до виду, поміщені в середовище для кріоконсервації і заморожені при -70 °C (-20 °C) для подальших досліджень в ЦРЛ.

Якщо після висіву на щільних поживних середовищах ріст відсутній, відібрати 1 мл бульйонної культури з початкового флакона для гемокультур в кріопробірку, заморозити зразок при -70 °C (-20 °C) для подальшого проведення ПЛР в ЦРЛ.

У випадку, якщо після закінчення 5 днів інкубації система не дає сигналу про наявність росту, проводять висів з флаконів на чашки з КА та ША, якщо після висіву ріст на щільних середовищах відсутній, приготувати мазок з бульйону, пофарбувати за Грамом. Якщо в мазку виявлені мікроорганізми, відібрати 1 мл бульйонної культури з початкового флакона для гемокультур в кріопробірку, заморозити зразок при -70 °C (-20 °C) для подальшого проведення ПЛР в ЦРЛ.

Якщо аналізатор повністю завантажений, але в лабораторію поступили нові посіви крові необхідно:

Видалити з приладу флакони з посівами, які інкубувалися довше за все, і продовжити інкубацію їх в термостаті при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 до 5 діб, щоденно переглядаючи на наявність росту. При появі росту або після 5 діб інкубації навіть при відсутності візуально помітного росту, провести висів на чашки з ША та КА. Зробити мазок і пофарбувати за Грамом. Повідомити про результати бактеріоскопії лікуючого лікаря.

Провести ідентифікацію отриманих культур згідно стандартним схемам. Провести визначення чутливості до антибактеріальних препаратів.

Якщо після висіву ріст на щільних середовищах відсутній, приготувати мазок з бульйону, пофарбувати за Грамом. Якщо в мазку виявлені мікроорганізми, відібрати 1 мл бульйонної культури з початкового флакона для гемокультур в кріопробірку, заморозити зразок при -70 °C (-20 °C) для подальшого проведення ПЛР в ЦРЛ.

Експрес-методи діагностики

Одними з найпростіших методів, що дозволяють швидко дати висновок про відсутність або наявність в СМР хворого специфічних антигенів збудників, є реакція ЛА і імунохроматографічний тест.

Реакція латекс-аглютинації. При проведенні пробопідготовки до ЛА і власне реакції необхідно точно слідувати інструкції, що додається до набору реактивів. Одну краплю кожного латексного реактиву (заздалегідь реактиви рекомендується ретельно струсити) нанести на спеціальні паперові карти, прикладені до набору. Потім додати супернатант або фільтрат СМР до кожної краплі латексного реактиву. Перемішати чистим аплікатором. Обережно похитати паперову карту. Поява аглютинації протягом декількох хвилин з одним з реактивів свідчить про присутність у досліджуваному зразку специфічного антигена.

Експрес тест "Binax NOW Streptococcus pneumoniae Test" є імунохроматографічним тестом, що проводиться на мембрані, для виявлення розчинного антигену пневмокока в СМР.

Кролячі антитіла до антигену S.pneumoniae адсорбовані у вигляді смуги на нітроцелюлозної мембрани в зоні читання результату. Козячі антитіла проти IgG кролика адсорбовані на тій же мембрані у вигляді другої смуги (контрольна лінія). Кролячі антитіла до антигену S.pneumoniae разом з антивидовими антитілами, кон'юговані з пофарбованими частинками для візуалізації, нанесені на волокнисту інертну підкладку і висушені. Підкладка, яка містить кон'югат та мембранна смужка з'єднані для формування тест-смужки. Дана тест-смужка вмонтована в касету у формі книжки, що відкривається, і має лунку для внесення тампона з досліджуваним зразком, розташовану на протилежному боці касети.

Для проведення тесту тампон, що додається до тесту, занурюють у досліджуваний зразок СМР, виймають і поміщають в лунку касети. Потім додають реагент A (буферний розчин), що додається до тесту у пластикової крапельниці. Касету закривають для приведення досліджуваного зразка в контакт з тест-смужкою. Антиген S.pneumoniae, що міститься в досліджуваному зразку, зв'язується з розташованими на підкладці антитілами пофарбованого кон'югату, і цей забарвлений комплекс антиген-кон'югат зв'язується за рахунок наявності антигена з іммобілізованими на мембрані кролячими антитілами до антигенів S.pneumoniae, формуючи пофарбовану лінію в зоні читання зразка. Іммобілізовані на смужці у вигляді лінії козячі антитіла проти IgG кролика також зв'язують пофарбований кон'югат, формуючи контрольну лінію.

Облік результатів тесту проводять по наявності або відсутності візуально помітних забарвлених ліній від рожевого до пурпурного кольору.

Позитивний результат, який реєструється протягом 15 хвилин, у залежності від концентрації антигену, присутнього в зразку СМР, включає появу двох пофарбованих ліній в зоні читання результату.

Негативний результат, також читається через 15 хвилин, дає лише одну пофарбовану контрольну лінію і свідчить про те, що антиген S.pneumoniae в досліджуваному зразку СМР не виявлений.

Відсутність пофарбованої контрольної лінії, незалежно від наявності або відсутності пофарбованої лінії в зоні читання результату, свідчить про недійсність проведеного тесту.

4.3.3. Ідентифікація збудників бактеріальних менінгітів

Neisseria meningitidis

Характеристика збудника. За "Визначником бактерій Берджі" Neisseria meningitidis, відноситься до роду Neisseria. Рід Neisseria належить до "Групи грамнегативних аеробних та мікроаерофільних паличок і коків". Морфологічно клітини менінгококів мають округлу форму і розміри порядку 0,6 - 1,0 мкм. Величина мікробних клітин і їх форма можуть розрізнятися, що визначає характерну для менінгококів ознаку клітинного "поліморфізму". Ця ознака особливо виражена в мазках із свіжих культур, при цьому загальна морфологічна картина культурального мазка, пофарбованого за Грамом, має вид лежачих безладно поліморфних (по величині і забарвленню) грамнегативних коків (ефект "розсипаного гороху"). Парне розташування менінгококів (диплококів) спостерігають в препаратах, приготованих з рідин і органів ураженого організму. В СМР менінгококи часто розташовуються внутрішньолейкоцитарно і мають форму кавового зерна.

Менінгококи нерухливі, спор не утворюють, джгутиків не мають, аероби, надзвичайно чутливі до дії факторів зовнішнього середовища. Температурний оптимум життєдіяльності - +37 °C в атмосфері з підвищеним вмістом CO2 (5 - 10%) і вологості. Менінгококи потребують високопоживних середовищ, що містять нативні білки або кров тваринного походження. При рості на щільних поживних середовищах утворюють невеликі, злегка опуклі, напівпрозорі колонії з ідеально рівними краями. При інкубації посівів в термостаті протягом 2 - 5 днів колонії збільшуються в розмірі, стають менш прозорими і краї їх набувають нерівний вигляд. Біохімічна активність менінгококів невелика, з числа багатьох вуглеводів вони ферментують тільки глюкозу і мальтозу з утворенням кислоти без газу, не розріджують желатин, оксидазо-, каталазопозитивні. Відповідно до особливостей будови полісахаридної капсули менінгококи підрозділяють на 12 серогруп: A, B, C, X, У, Z, W-135, 29-E, K, H, L, I.

Ідентифікація Neisseria meningitidis

Виділення та ідентифікацію менінгококів виконують по наступних тестах:

1. Виявлення в нативному матеріалі диплококів з характерними морфологічними ознаками.

2. Характерний ріст тільки на високопоживних середовищах.

3. Типова морфологія культурального мазка за Грамом.

4. Наявність активності каталази і цитохромоксидази.

5. Сахаролітична активність відносно глюкози і мальтози.

6. Виявлення специфічних антигенів в СМР та/або сироватці крові в ЛА.

При посіві на поживні середовища і подальшій інкубації протягом 18 - 24 годин при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 виявляються наступні культуральні властивості: на чашках з ША та КА менінгококи ростуть у вигляді ніжних напівпрозорих сіруватих колоній з ідеально рівними краями, з блискучою поверхнею, розміром 1 - 2 мм. Мають маслянисту консистенцію, не міняють кольору середовища.

Тест на каталазу. Метод базується на здатності мікроорганізмів, що мають фермент каталазу, розщепляти перекис водню, утворюючи воду та кисень.

На предметне скло нанести краплю 10% перекису водню, в неї пластиковою одноразовою петлею або скляною паличкою внести 18 - 24 годинну культуру досліджуваного штаму, вирощену на КА при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2, і розтерти круговими рухами. Слід намагатися не зачепити частинки КА, оскільки еритроцити в КА можуть стати причиною хибнопозитивної реакції.

При позитивній реакції утворюється піна (бульбашки газу).

Позитивний контроль - Staphylococcus spp.

Негативний контроль - S.pneumoniae.

Тест на цитохромоксидазу. Реагент тетраметил-пара-фенілендиаміна гідрохлорид набуває синьо-фіолетового забарвлення під впливом мікроорганізмів, продукуючих фермент цитохромоксидазу.

Для постановки тесту використовують комерційні диски або стрипи для визначення оксидази.

Пластиковою петлею або дерев'яною паличкою зняти колонію 18 - 24 годинної культури досліджуваного штаму, вирощену на КА при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2. Втерти її в оксидазний стрип або диск. Не слід користуватися нихромовою петлею із-за вірогідності одержати хибнопозитивну реакцію.

Оксидазопозитивні культури через 10 - 30 сек. дають синьо-фіолетове забарвлення.

Позитивний контроль - контрольний штам N.meningitidis або N.lactamica.

Негативний контроль - S.pneumoniae або S.mitis.

Визначення сахаролітичної активності. Пластиковою петлею проводять посів чистої 18 - 24 годинної культури, вирощеної на КА при температурі (36 ± 1) °C в атмосфері CO2, на попередньо прогріті до кімнатної температури щільні поживні середовища з вуглеводами.

Посів проводять шляхом приблизно 8 "уколів" петлею з посівним матеріалом в пробірку з середовищем, занурюючи її на глибину 10 мм від поверхні. Для кожного вуглеводу використовують окремі одноразові петлі.

Посіви інкубують при температурі (36 ± 1) °C без атмосфери CO2 від 72 годин до 5 діб.

Позитивний результат - поява видимих ознак каламутності і жовтого забарвлення у верхній частині стовпчика середовища.

Зміна кольору середовища на жовтий без помутніння, як правило, не є позитивною реакцією.

Для контролю якості використовують контрольні штами N.meningitidis, N.lactamica і N.sicca.

Метод дає можливість диференціювати різні види нейсерій і деякі інші види мікроорганізмів (таблиця 1).

Таблиця 1. Сахаролітична активність Neisseria і Moraxella

Менінгококи ферментують глюкозу і мальтозу з утворенням кислоти. Іноді спостерігають варіабельність сахаролітичної активності у різних штамів одного і того ж виду (3% менінгококів не ферментують глюкозу, 10% менінгококів не ферментують мальтозу.

Визначення серогрупи у менінгококів проводять в реакції аглютинації на склі з набором серогрупових антисироваток, що аглютинують, або в реакції ЛА з відповідним набором реактивів. Реакцію проводять тільки з чистою культурою менінгококів, що пройшла всі етапи ідентифікації. При проведенні реакції необхідно точно слідувати інструкції, що додається до набору антисироваток або латексних реактивів.

Схема виділення та ідентифікації Neisseria meningitidis

Ідентифікація Streptococcus pneumoniae.

Характеристика збудника. Збудником пневмококових менінгітів є Streptococcus pneumoniae (пневмокок), який (згідно "Визначника бактерій Берджі") входить до складу роду Streptococcus (група стрептококів ротової порожнини), включених в 17-у групу "Грампозитивні коки". Це овальні, іноді витягнуті уподовж осі ланцетоподібні коки, діаметром 0,5 - 1,0 мкм, розташовуються парами і оточені загальною капсулою. Пневмококи нерухливі, спор не утворюють, є факультативними анаеробами. Для культивування потребують багатих поживних середовищ, віддають перевагу капнофільним умовам (5 - 10% CO2). Температурний оптимум 37 °C. Пневмококи каталазо- і оксидазонегативні. Розкладають до кислоти глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, не ферментують маніт, саліцин, сорбіт. Ферментують інулін.

Виділення та ідентифікацію пневмококів виконують по наступних тестах:

1. Виявлення в нативному матеріалі (ліквор та/або кров) диплококів, оточених капсулою.

2. Ріст на середовищах, що містять кров, з утворенням альфа-гемолізу.

3. Характерна морфологія культурального мазка за Грамом.

4. Позитивна проба з оптохіном.

5. Чутливість до жовчних кислот (дезоксихолатна проба або тест на розчинність в жовчі).

6. Позитивний тест "Бинакс" (для СМР).

7. Виявлення специфічного антигена в реакції ЛА (при позитивному тесті "Бінакс" ЛА не проводять!).

При посіві на поживні середовища і подальшій інкубації протягом 24 годин при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 виявляють наступні культуральні властивості: ріст на КА та ША у вигляді невеликих, сіруватих, із зеленуватою зоною альфа-гемолізу навколо, колоній. Свіжі колонії опуклі, але у міру старіння центр колонії опускається вниз, і вони набувають характерну форму "шашок". Колонії схильні до аутолізу, що пов'язано з активністю внутріклітинних ферментів.

Біохімічна активність пневмококів багато в чому співпадає з активністю стрептококів, що зеленять. Для диференціальної діагностики використовують пробу з оптохіном і дезоксихолатну пробу (тест на розчинність в жовчі).

Проба з оптохіном (оптохін пригнічує ріст пневмококів): на чашку з КА суцільним газоном засівають досліджувану 18- 24 годинну культуру, вирощену в атмосфері CO2. На поверхню середовища поміщають диск діаметром 6 мм, що містить 5 мкг оптохіна. Після інкубації при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2. протягом 18 - 24 годин навкруги диска утворюється зона інгібіції росту, діаметр якої яку виміряють за допомогою штангенциркуля або лінійки з верхньої сторони чашки c відкритою кришкою.

Позитивний контроль - контрольна культура S.pneumoniae ATCC 49619, негативний контроль - S.mitis ATCC 49456.

Позитивний результат - зона затримки росту ≥ 14 мм. Мікроорганізм є S.pneumoniae.

Негативний результат - немає зони затримки росту. Мікроорганізм не є S.pneumoniae.

Сумнівний результат - зона затримки росту 9 - 13 мм. Результат має бути перевірений за допомогою дезоксихолатної проби.

Варто пам'ятати, що іноді пневмококи можуть бути оптохін-резистентними.

Дезоксихолатна проба: використовують 2% розчин дезоксихолату натрію. Для цього готують суспензію досліджуваної 18 - 24 годинної культури, вирощеної на КА в атмосфері CO2, в 1 мл фізіологічного розчину до каламутності 1 за стандартом McF. Половину суспензії переносять в пробірку марковану словом "тест", іншу половину залишають в пробірці маркованій словом "контроль". В пробірку "тест" додають 500 мкл 2% розчину дезоксихолату натрію, в пробірку "контроль" - 500 мкл фізіологічного розчину. Пробірки струшують і інкубують 1 - 2 години при температурі (36 ± 1) °C в атмосфері CO2. Повне прояснення рідини в пробірці "тест" в порівнянні з пробіркою "контроль" свідчить про належність культури до S.pneumoniae. Позитивний контроль - S.pneumoniae ATCC 49619, негативний контроль - S.mitis ATCC 49456.

Часткове просвітлення суспензії (часткову розчинність) не прийнято вважати позитивним результатом тесту. Частково розчинні штами при наявності зон затримки росту оптохіном діаметром менше 14 мм не є пневмококами.

Схема виділення та ідентифікації Streptococcus pneumoniae

Ідентифікація Haemophilus influenzae

Характеристика збудника. Згідно "Визначника бактерій Берджі" Haemophilus influenzae відноситься до роду Haemophilus, який входить в родину Pasteurellaceae (підгрупа 3), що відноситься до 5 групи мікроорганізмів, що включає всі факультативно-анаеробні грамнегативні палички. З організму людини можна виділити 8 видів гемофілів, причому тільки 2 з них - Haemophilus influenzae і Haemophilus duckreyi є основними патогенами людини. Haemophilus influenzae - невеликі (0,3 - 0,4 х 1 - 1,5 мкм) грамнегативні, сферичні, овальні і паличковидні клітини. Іноді утворюють нитки і мають помітний поліморфізм, особливо в матеріалі від хворих, які одержували бета-лактамні антибіотики. Гемофіли нерухливі, спор не утворюють, повільно забарвлюються аніліновими фарбниками. Каталазопозитивні, оксидазопозитивні.

Haemophilus influenzae - факультативний анаероб, оптимальні умови культивування - температура 37 °C і атмосфера з підвищеним вмістом CO2. Більшість видів Haemophilus при культивуванні вимагає присутності в поживному середовищі X та/або V факторів. Термостабільний фактор росту X (гемін) утворюється з гема шляхом заміни двовалентного іона заліза на тривалентний. Гем, у свою чергу, удосталь міститься в еритроцитах, входить до складу гемоглобіну. Фактор V - це термолабільний кофермент нікотинамідаденіндинуклеотид (НАД), що бере участь в окислювально-відновних реакціях бактеріальних клітин. Фактор V синтезується рядом бактерій (сарцинами, стафілококами, нейсеріями і іншими) і присутній в тваринних клітинах, у тому числі в еритроцитах. Додавання в поживне середовище НАД задовольняє потребу мікроорганізмів в факторі V. Усередині роду мікроорганізми диференціюють по потребі у вказаних факторах росту і на підставі біохімічних властивостей, які наведені в таблиці 2.

Haemophilus influenzae потребує як X, так і в V факторів росту. Температурні межі росту гемофілів 24 - 43 °C, оптимальна температура 37 °C. Виходячи з того, що гемофілам для культивування необхідні фактори росту (X та/або V), оптимальним середовищем є ША, в який входить гріта кров, що містить X і V фактори, що виділяються при термічному руйнуванні еритроцитів.

Капсульовані штами Haemophilus influenzae містять капсульний полісахарид одного з 6 типів (a, b, з, d, e, f), які відрізняються за складом вуглеводів, що входять в нього і антигенним властивостям.

Основну епідемічну небезпеку представляє Haemophilus influenzae типу "b", оскільки викликає найважчі менінгіти, сепсис, пневмонії і інші інфекційні захворювання. Капсульний антиген Hib складається з полірибозилрібітолфосфата (PRP або ПРФ).

Таблиця 2. Ідентифікація Haemophilus spp., по їх потребі в ростових факторах та наявності β-гемолиза на агарі з додаванням кінської крові

__________
1 H.parainfluenzae орнітиндекарбоксилазапозитивний, тоді як H.paraphrophilus - негативний.
2 Хоча потреби представників цих видів в геміні і НАД різні, H.aphrophilus і H.paraphrophilus були недавно перекваліфіковані як окремі види, що належать до нового роду - Aggregatibacter aphrophilus.

Визначення потреби в X і V факторах росту за допомогою комерційних дисків з X, V і X + V факторами. Приготувати помірно густу суспензію 18 - 24 годинної культури досліджуваного штаму, вирощеного на ША в атмосфері CO2 (зіставну з стандартом 1,0 за McF) у пептонній воді або бульйоні.

Намагатися не вносити частинок ША в суспензію, оскільки це може викликати хибнопозитивний результат або ріст на всій поверхні агара.

Посіяти бавовняним тампоном "газоном" на поверхню середовища без додавання крові, дефіцитне по X і V факторах (триптиказо-соєвий або колумбійський агар).

На одній чашці можна дослідити два ізолята, але треба забезпечити, щоб культури не стикалися.

Після висихання інокулята розмістити паперові диски з X, V і X + V факторами на поверхні агару у формі трикутника, як мінімум на відстані 3,5 см один від одного, щоб уникнути взаємної дифузії факторів, що дає помилкові результати, а саме - ріст навколо диску, де результат мав бути негативним.

Обережно перевернути чашки догори дном і інкубувати протягом 18 - 24 години при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2.

Після інкубації посіви переглядають, фіксують наявність або відсутність росту навколо цих трьох дисків. Наявність росту навколо диска указує на потребу в даному факторі (див. мал. 1).

Мал. 1. Визначення потреби в ростових факторах: геміні (фактор X) та НАД (фактор V), з використанням діагностичних паперових дисків

Інтерпретація результатів. H.Influenzae та H.haemolyticus будуть рости тільки навколо паперового диска, що містить X + V фактор. З метою диференціації цих двох видів необхідно перевірити наявність гемолізу на агарі з додаванням кінської або кролячій крові.

Інші види Haemophilus spp. будуть рости навколо діагностичних дисків, що містять X, V і X+V фактори.

Штами для контролю якості:

X і V фактори - Haemophilus influenzae;

тільки V фактор - Haemophilus parainfluenzae NCTC 10665.

Тест на сателітизм. У випадку відсутності дисків з X,V і X + V, для визначення потреби в V факторі може бути виконаний тест на сателітизм з Staphylococcus aureus.

1. Посіяти свіжу культуру передбачуваного штаму H.influenzae на КА.

2. Посіяти S.aureus штрихом упоперек посіву H.influenzae.

3. Інкубувати протягом ночі при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2.

КА містить достатню кількість X-фактора (геміна), але не достатньо V фактора (НАД). Staphylococcus aureus в процесі росту продукує V-фактор і колонії Haemophilus influenzae ростуть на ділянках, розташованих поряд з штрихами S.aureus (див. мал. 2).

Мал. 2. Тест на сателітизм для визначення потреби в V факторі

Додатково, якщо тест на сателітизм проводиться на КА, можна також спостерігати наявність або відсутність гемолізу поряд з колоніями Haemophilus. Ця інформація може бути використана як підтвердження присутності гемолітичних видів роду Haemophilus.

Виділення та ідентифікацію Haemophilus influenzae, проводять по наступних тестах:

1. Виявлення в СМР поліморфних грамнегативних кокобацил.

2. Ріст тільки на середовищах, що містять X і V фактори росту (ША).

3. Характерна морфологія культурального мазка, пофарбованого за Грамом.

4. Виявлення потреби в X і V факторах росту.

5. Визначення відповідних антигенів в реакції ЛА.

При посіві на поживні середовища і подальшій інкубації протягом 24 годин при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 і підвищеною вологістю виявляють наступні культуральні властивості: на ША Haemophilus influenzae росте у вигляді сірих, слизових, блискучих колоній з рівними краями, діаметром 0,2 - 2 мм. Ріст культури часто супроводжується різким "мишачим запахом" (запах індолу).

При мікроскопії культури (фарбування за Грамом) видно грамнегативні поліморфні палички або кокобацили розміром від точкових до середніх, звичайно менше 1 мкм завширшки і різні по довжині, часто бачать капсулу, розташовані безладно. Іноді знаходять короткі і довгі (ниткоподібні) ланцюжки.

Схема виділення та ідентифікації Haemophilus influenzae

5. Приготування, зберігання поживних середовищ, реактивів та контроль якості

5.1. Загальні вимоги

Для приготування середовищ має використовуватися дефібринована бараняча або кінська кров. Кров людини для приготування поживних середовищ не придатна.

Свіжа людська кров містить: антитіла, комплемент, які негативно впливають на результати досліджень.

Донорська кров з вичерпаним терміном придатності, містить:

цитрат (хелатна добавка) - пригнічує ріст бактерій, видаляючи нутрієнти;

глюкозу (в її присутності β-гемоліз виглядає як α- гемоліз).

Крім того, людська кров може містити такі небезпечні патогени такі як: ВІЛ, віруси гепатитів B, C і ін.

5.2. Зберігання готових поживних середовищ

в сухому, захищеному від світла місці;

оддалік джерел тепла. Середовища, що містять кров, органічні добавки або антибіотики повинні зберігатися в холодильнику при +4 °C;

термін придатності готових середовищ, при їх зберіганні в холодному темному місці залежить від тари, що використовується:

пробірки з ватно-марлевими пробками - 3 тижні;

пробірки з кришками, що не нагвинчуються - 2 тижні;

чашки Петрі в запечатаних пластикових пакетах - 2 тижні.

5.3. Контроль якості поживних середовищ

Кожна партія поживних середовищ повинна бути перевірена на якість перед використанням.

Контроль pH. Якщо pH відрізняється від заявленої більш ніж на 0,2 од., довести до потрібного значення лугом/кислотою, або приготувати нову партію середовища.

Контроль стерильності. Інкубація чашок 2 - 5 діб при (36 ± 1) °C.

Контроль ростових властивостей. Перевірка якості середовищ по їх здатності підтримувати ріст контрольних мікроорганізмів - використовують стандартну посівну дозу і оцінюють результат кількісно і якісно.

Для контролю використовують 18 - 24 годинну культуру контрольних штамів, вирощених на відповідному середовища при температурі (36 ± 1) °C в атмосфері CO2.

Дату приготування та результати контролю якості поживних середовищ реєструють в формі № 256/о "Журналі приготування та контролю поживних середовищ".

Можливі проблеми при приготуванні середовищ

Перегрів або дуже довге нагрівання -

Руйнує ростові фактори

Викликає розкладання сахарів

Викликає утворення осаду

Змінює pH

Позбавляє агар гелеутворюючих властивостей.

5.4. Приготування поживних середовищ

5.4.1. Кров'яний агар. В якості основи середовища використовують колумбійський, триптиказо-соєвий агари тощо.

До розплавленої і охолодженої до температури 50 °C основи додати 5% дефібрінованої крові.

Ретельно перемішати, уникаючи утворення пухирців і піни, і розлити в чашки Петрі.

Контроль якості. Контроль ростових якостей. 18 - 24 годинну культуру контрольних штамів S.pneumoniae або N.meningitidis, вирощену на КА при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2, посіяти на поверхню свіжеприготовленого середовища. Інкубувати 24 год. в атмосфері CO2. Провести облік результатів.

Контроль стерильності: інкубувати незасіяну чашку протягом 48 год. при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2.

Середовище придатне для використання якщо:

колонії S.pneumoniae типові за формою і розміром, мають колір від сірого до сіро-зеленого, їх має оточувати виразна зона α-гемолизу зеленого кольору;

колонії N.meningitidis сірого кольору, крупні, округлої форми, гладенькі, вологи, з блискучою поверхнею, опуклі, мають ідеально рівні краї;

тест на стерильність негативний - після 48 год. інкубації ріст на чашці з досліджуваним середовищем відсутній.

5.4.2. "Шоколадний" агар. До 100 мл розплавленої і охолодженої до 50 °C основи колумбійського агару додати 2,5 мл дефібринованої стерильної крові, ретельно перемішати і помістити на 2 хвилини у водяну баню при 80 - 85 °C. Додати ще 2,5 мл крові ретельно перемішати і знов помістити у водяну баню на 3 - 6 хв. Кров перед використанням бажано прогріти в термостаті при 37 °C. Колір шоколадного агару має бути світло-коричневим. Коли середовище охолоне до 50 °C, можна додати ростові добавки Isovitalex або Vitox (відповідно до інструкції, що додається до упаковки з ростовими добавками).

Середовище розливають в чашки Петрі. Зберігають не більше двох тижнів в целофанових пакетах при +4 ° - +6 °C.

Контроль якості. 18 - 24 годинну культуру контрольних штамів S.pneumoniae, N.meningitidis і H.Influenzae, вирощену на ША при при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 посіяти на поверхню свіжеприготовленого середовища.

Середовище придатне для використання якщо:

колонії N.meningitidis і H.influenzae крупні, округлої форми, гладенькі, опуклі, напівпрозорі, безбарвні або сірі. Не повинне спостерігатися зміни кольору поживного середовища;

колонії S.pneumoniae невеликі, мають колір від сірого до сіро-зеленого, їх повинна оточувати зона альфа-гемолізу слабо-зеленого кольору;

тест на стерильність - негативний - після 48 годин інкубації ріст на чашці з досліджуваним середовищем відсутній.

5.4.3. "Шоколадний" агар на основі сухого гемоглобіну

Розчинити і з дотриманням стерильності розлити на аліквоти (2 мл). Аліквоти можна заморозити при -20 °C і використовувати у міру необхідності.

Коли розчини A і B охолонуть приблизно до 50 °C, обережно змішати їх, уникаючи утворення пухирців.

Додати до отриманої суміші розчинів A і B 2 мл розчину С, перемішати.

Розлити в чашки Петрі. Провести контроль якості згідно протоколу для ША на основі свіжої крові.

Середовище в чашках Петрі зберігати не більше двох тижнів в целофанових пакетах при +4 ° - +6 °C.

5.4.4. Цистин-триптиказний агар (ЦТА) з додаванням 1% вуглеводів (напіврідке поживне середовище) для визначення сахаролітичної активності менінгококів

Наважку сухої основи ЦТА (кількість зазначена на етикетці конкретної серії (лоту) препарату), суспендувати в 900 мл дистильованої води. Ретельно перемішати, підігріти при частому помішуванні і кип'ятити протягом 1 хвилини до повного розчинення порошку.

Автоклавувати при 121 °C протягом 15 хвилин.

Охолодити до 50 °C на водяній бані.

Приготувати 10% розчин глюкози шляхом додавання 10 г глюкози до 100 мл дистильованої води. Стерилізувати фільтруванням (фільтр з розміром пор 0,22 мікрон).

Дотримуючись правил стерильності, додати 100 мл 10% розчину глюкози, приготованого як зазначено вище, до 900 мл середовища ЦТА для отримання кінцевої 1% концентрації глюкози.

Дотримуючись правил стерильності, розлити по 7 мл середовища в скляні пробірки 16 х 125 мм з кришками, що загвинчуються.

Аналогічно приготувати середовища з мальтозою, лактозою і сахарозою.

Зберігати при 4 °C. Перед використанням підігріти до кімнатної температури (25 °C).

Контроль якості. Довести середовища ЦТА з вуглеводами до кімнатної температури (25 °C) і промаркувати пробірки з зазначенням назв контрольних штамів.

Посіяти одноразовою петлею 3 - 5 колоній 18 - 24 годинних культур контрольних штамів N.meningitidis, N.lactamica і N.sicca, вирощених на КА при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2, уколом в стовпчик свіжеприготовленого середовища. Для цього приблизно 8 разів ввести петлю з культурою в ЦТА з додаванням вуглеводів, занурюючи її на глибину 10 мм від поверхні середовища.

Для кожного середовища з вуглеводом використовують окремі одноразові петлі.

Нещільно загвинтити кришку кожної пробірки і помістити їх в термостат при температурі (36 ± 1) °C без CO2. Інкубувати посіви від 3 до 5 діб.

При обліку результатів враховують появу видимих ознак каламутності і зміну кольору на жовтий.

Інтерпретація результатів

Поява видимих ознак каламутності і жовтого кольору у верхній частині середовища свідчить про ріст бактерій і продукцію кислоти та інтерпретується як позитивний результат.

N.meningitidis має утилізувати глюкозу і мальтозу, але не утилізує лактозу та сахарозу.

N.lactamica має утилізувати глюкозу, мальтозу і лактозу, але не утилізує сахарозу.

N.sicca має утилізувати глюкозу, мальтозу і сахарозу, але не утилізує лактозу.

5.4.5. Трансізоляційне середовище (TI, Trans-Isolate Medium)

Використовується в готовому вигляді.

Контроль якості. Приготувати суспензії з 18 - 24 годинних культур контрольних штамів N.meningitidis, S.pneumoniae і H.influenzae вирощених на КА або ША при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2. Їх концентрація повинна відповідати 0,5 за стандартом McF (~ 1,5 х 108 КУО/мл).

Приготувати їх серійні розведення на серцево-мозковому бульйоні для отримання інокулятів густиною 103 КУО/мл.

Зняти стерильним пінцетом алюмінієвий ковпачок з гумової пробки у 3-х флаконів з TI-середовищем і обробити пробки 70% розчином ізопропанолу або етанолу.

Не використовувати для обробки розчин повідон-йоду!

За допомогою стерильного шприца з голкою посіяти у флакони з TI-середовищем по 100 мкл суспензій контрольних штамів густиною 103 КУО/мл (посівна доза 100 КУО). Суспензії мають бути засіяні не пізніше 15 хвилин з моменту їх приготування.

Для кожного флакона з TI-середовищем використовують новий стерильний шприц з голкою. Після засіву і витягання голки шприца з гумової пробки флакон з TI-середовищем кілька разів перевертають для перемішування вмісту.

В кожний засіяний флакон з TI-середовищем ввести стерильну вентиляційну голку. Вентиляційна голка не повинна занурювалася в бульйон.

Інкубувати вентильовані флакони з TI-середовищем 18 - 24 годин при температурі (36 ± 1) °C в атмосфері CO2.

Після закінчення часу інкубації флакони дістати з термостату, витягнути і утилізувати вентиляційні голки. Перевернути кожний флакон з TI-середовищем кілька разів для перемішування вмісту.

За допомогою стерильних шприців з голками відібрати по 10 мкл цього бульйону нанести на поверхню поживного середовища у чашці Петрі і розсіяти стерильною петлею штриховим методом для отримання ізольованих колоній контрольних штамів на КА для N.meningitidis і S.pneumoniae, а також на ША для культури H.influenzae.

Чашки з посівами інкубують 18 - 24 годин при температурі (36 ± 1) °C в атмосфері CO2.

Інтерпретація результатів

Колонії N.meningitidis на КА мають бути сірого кольору, крупними, округлої форми, гладкими, вологими, з блискучою поверхнею, опуклими, мають ідеально рівні краї.

Колонії S.pneumoniae на КА мають бути невеликими, мати колір від сірого до сіро-зеленого, їх повинна оточувати виразна зона альфа-гемолізу зеленого кольору.

Колонії H.influenzae на ША мають бути крупними, округлої форми, гладкими, опуклими, напівпрозорими, безбарвними або сірими. Не повинне спостерігатися зміни кольору поживного середовища.

6. Основні заходи щодо внутрішньолабораторного контролю якості

Внутрішньолабораторний контроль якості досліджень - це процес ефективного та систематичного внутрішнього спостереження за робочим процесом в лабораторії з метою належного дотримання вимог нормативної документації, яка регламентує всі аспекти діяльності лабораторії.

Внутрішній контроль якості є складовою системи управління якістю в лабораторії і гарантує, що результати, отримані в даній лабораторії, є точними, достовірними та відтворюваними.

Повинні бути розроблені стандартні операційні протоколи (СОП) для всіх методик, що використовуються.

{Абзац четвертий розділу 6 виключено на підставі Наказу Міністерства охорони здоров'я № 38/а від 15.01.2014}

{Абзац п'ятий розділу 6 виключено на підставі Наказу Міністерства охорони здоров'я № 38/а від 15.01.2014}

{Абзац шостий розділу 6 виключено на підставі Наказу Міністерства охорони здоров'я № 38/а від 15.01.2014}

Контроль температури в термостатах, холодильниках та морозильних камерах проводять щоденно перед початком роботи. Результати вимірів реєструють у контрольному листі і завіряють підписом виконавця. У випадку перевищення припустимих відхилень температури (див. нижче), співробітник, що проводить реєстрацію, повинен повідомити про це керівникові підрозділу і провести регулювання температури для компенсації виявлених відхилень. Якщо врегулювати температуру не вдається, викликають сервісну службу.

холодильник +4 °C, допустимий діапазон відхилень +(2 - 8) °C;

морозильна камера: -20 °C , допустимий діапазон відхилень - (17 - 23) °C;

морозильна камера: -70 °C, допустимий діапазон відхилень >-65 °C;

термостат: +36 °C, допустимий діапазон відхилень + (35 - 37) °C.

Листи обліку температури в холодильнику/морозильнику, термостаті мають бути прикріплені на зовнішній поверхні обладнання.

Контроль роботи автоклавів проводять фізичним (кожну закладку), хімічним (кожну закладку) та біологічним (1 раз на місяць) методами. Використовують максимальні термометри, хімічні та біологічні індикатори. Результати фіксують у формі первинної облікової звітності № 257/о "Журнал контролю роботи стерилізаторів повітряного парового (автоклаву)".

Оцінку загального стану центрифуг проводять візуально при кожному використанні. Про будь-які виникаючі несправності слід повідомляти негайно. Несправне обладнання не повинне використовуватися.

Лабораторія має вести облік отриманих наборів реагентів, барвників, поживних середовищ в спеціальному журналі із зазначенням дати отримання, кількості, терміну придатності, дати відкриття упаковки.

Реагенти, поживні середовища готують у відповідності до затверджених методик та інструкцій щодо їх застосування.

Приготовлені розчини реактивів зберігають в герметично закритих ємкостях з темного скла. На кожній ємкості повинен бути напис з зазначенням: назви розчину; дати його приготування, (стерилізації, якщо необхідно), терміну придатності і зазначення прізвища фахівця, який готував розчин.

Всі вихідні розчини зберігаються не більше терміну придатності та постійно поповнюються.

Всі контейнери (флакони, упаковки) з поживними середовищами, реактивами і барвниками комерційного виробництва повинні мати на етикетках інформацію про дату виготовлення, термін придатності та відмітку про дату отримання в лабораторію і дату розкриття упаковки.

Будь-які неякісні матеріали або із простроченим терміном придатності не повинні використовуватись.

Всі поживні середовища повинні піддаватись контролю якості після приготування. Результати контролю якості реєструють у формі первинної облікової звітності № 256/о "Журнал приготування і контролю поживних середовищ".

Дезінфікуючі засоби мають готуватися відповідно до інструкцій виробника. На всіх ємностях з дезрозчинами має бути зазначена назва, концентрація та дата приготування.

7. Процедура ведення еталонних (контрольних) бактеріальних культур

7.1. Загальні положення

Ведення еталонних культур має забезпечувати максимальне збереження типових властивостей штамів, що досягається дотриманням принципів їх культивування, контролю і зберігання.

Основні принципи ведення еталонних бактеріальних культур:

- кількість пасажів тестового мікроорганізму на поживних середовищах з моменту його відновлення до моменту його цільового використання повинна бути, по можливості, мінімальною;

- рух культури з моменту її відновлення після ліофилізації до цільового використання повинен бути однонаправленим, тобто запаси еталонної культури не повинні поповнюватися за рахунок (з) запасів робочої культури. Небажано поповнювати запаси робочої культури шляхом отримання її субкультур;

- контроль еталонного штаму на відповідність типовим властивостям проводять перед закладкою на тривале зберігання і перед заповненням запасів робочої культури;

- штами із зміненими властивостями для подальшої роботи не використовують;

- для цільового використання придатні культури еталонного штаму, що пройшли з моменту висіву з середовища для зберігання запасів робочої культури (середовища для кріоконсервації) не більше 3 - 4 пасажів.

Всі роботи з культурами необхідно проводити в боксі біологічної безпеки 2-го класу.

Еталонні культури, заморожені в середовищах для кріоконсервації повинні зберігатися при -70 °C.

Робочі культури повинні зберігатися в аналогічних умовах.

При неможливості забезпечення таких умов для робочих культур, можливо зберігання при - 20 °С. В цьому випадку культури необхідно щомісячно перевивати і знов заморожувати. При зміні основних властивостей еталонного штаму, необхідно заповнити запас робочої культури з еталонної колекції, що зберігається при -70 °C.

Зберігання колекції еталонних (контрольних) культур, а також формування запасів робочої культури здійснюватиметься в ЦРЛ.

В еталонну частину колекції повинно бути поміщено на зберігання, як мінімум, 20 копій кожного штаму.

Запаси робочих культур розподілятимуться у міру необхідності (але не рідше 3-х разів на рік) між бактеріологічними лабораторіями дозорних регіонів.

Перелік еталонних штамів, що мають зберігатися в ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України"

Перелік штамів для забезпечення роботи лабораторій дозорних регіонів

1. HA9 Haemophilus parainfluenzae NCTC 7857 - негативний контроль в тесті на визначення потреби в XV факторах росту (для росту необхідний тільки V фактор);

2. HA61 Haemophilus influenzae серотип b ATCC 10211 - позитивний контроль в тестах на визначення потреби в XV факторах росту (для росту необхідні фактори X і V) та ЛА;

3. HA65 Haemophilus influenzae серотип f ATCC 9833 - позитивний контроль в тесті на визначення потреби в XV факторах росту (для росту необхідні фактори X і V) і негативний контроль в ЛА;

4. HA72 Haemophilus influenzae ATCC 49247 для контролю якості при визначенні чутливості до антибіотиків дискодифузійним методом;

5. HA73 Haemophilus influenzae NCTC 11315 - позитивний контроль при визначенні активності бета-лактамази;

6. H101 Streptococcus pneumoniae wild type - позитивний контроль (визначення чутливості до оптохіну, дезоксихолатна проба (розчинність в жовчі), ЛА);

7. H102 Streptococcus mitis wild type - негативний контроль (визначення чутливості до оптохіну, дезоксихолатна проба (розчинність в жовчі), контроль ростових якостей КА та агар Мюллера - Хинтона з 5% крові;

8. 10606 Neisseria lactamica - позитивний контроль (визначення активності цитохромоксидази, каталази і сахаролітичної активності).

Для оцінки ростових якостей поживних середовищ ША та НТМ агар (Haemophilus Test Medium) може бути використаний будь-який штам Haemophilus influenzae з колекції.

Еталонні штами HA60, HA62, HA63, HA64 і HA67 можуть бути використані як позитивні контролі в реакції аглютинації на склі. Доцільно продовжувати зберігати ці культури в ліофілізованому вигляді, при необхідності відновити ліофілізат, страхувати і помістити на зберігання в еталонну частину колекції в кількості не менше 20 копій, сформувати робочу частину колекції для цільового використання в ЦРЛ.

7.2. Методика ведення еталонних (контрольних) штамів

Процес ведення штамів в даному варіанті складається з наступних блоків:

- відновлення і контроль ліофілізованої культури;

- створення запасу еталонної культури (зберігання в умовах кріоконсервації);

- створення запасу робочої культури (зберігання в умовах кріоконсервації);

- підготовка культури для цільового використання;

- контроль видових і паспортних властивостей.

На відміну від широко поширеної методики ведення культур мікроорганізмів, заснованої на необмежених послідовних (лінійних) пересівах, дана схема ведення зводить до мінімуму кількість пасажів еталонної культури, що проводяться від моменту відновлення після ліофілізації до цільового використання. Такий підхід дозволяє скоротити вірогідність небажаних мутацій, які ведуть до втрати еталонних властивостей, або випадкового забруднення. Забракована лінія еталонної культури повинна бути у будь-який момент замінена нову.

7.2.1. Відновлення і контроль ліофілізованого еталонного штаму

За допомогою пили або різця надрізати вузький кінець ампули по всьому колу, так, щоб надріз знаходився приблизно в середині ватяного тампона, що знаходиться в ампулі. Далі нагріти кінець скляної пастерівської піпетки над полум'ям, поки він не придбає червоний колір, і негайно злегка натиснути їм на надріз на ампулі. Скло повинне тріснути уздовж надрізу. Якщо скло не тріснуло, повторити процедуру. Перед розділенням двох частин розкритої ампули швидко пропалити її над полум'ям. Обережно розділити 2 частини ампули, при цьому ватяний тампон повинен залишитися в тій частині, де знаходиться ліофілізована культура, помістити порожню частину ампули в контейнер для відходів. Дістати ватяний тампон з ампули за допомогою стерильного пінцета і додати в ампулу близько 500 мкл стерильної пептонної води, бульйону або фізіологічного розчину, помістити ватяний тампон назад в ампулу і залишити на декілька хвилин для регідратації. Далі за допомогою стерильної пастерівської піпетки ресуспендувати отриману суспензію і посіяти на щільні і рідкі поживні середовища:

- при роботі з видами роду Haemophilus на ША;

- рід Streptococcus - на КА та триптиказо-соєвий бульйон;

- рід Neisseria - на ША та КА;

Кожну культуру посіяти як мінімум на 2 чашки зі щільним середовищем і за необхідності в пробірки з рідким. Інкубувати посіви протягом 16 - 20 год. при (36 ± 1) °C, в атмосфері 5% CO2.

Посіви на чашках використовують для постановки тестів на відповідність отриманого штаму типовим властивостям еталонної культури. При підтвердженні типових властивостей еталонного штаму культуру розсівають на 20 або більш чашок для створення запасу еталонної культури (кріоконсервація). Ліофілізована культура між відновленням і поміщенням її на зберігання повинна пройти не більш 3 - 4-х пасажів.

Типові властивості:

Види роду Haemophilus - тинкторіальні і культуральні властивості, потреби в X і V факторах росту, аглютинація з відповідною антисироваткою або латексним реактивом;

Види роду Neisseria - тинкторіальні і культуральні властивості, активність цитохромоксидази і каталази, сахаролітична активність, аглютинація з відповідною антисироваткою або латексним реактивом;

Види роду Streptococcus - тинкторіальні і культуральні властивості, чутливість до оптохіну, розчинність в дезоксихолаті натрію, аглютинація з відповідною антисироваткою або латексним реактивом.

Культура із зміненими властивостями в роботу не допускається.

7.2.2. Створення запасів еталонної культури

При задовільному проходженні контрольних тестів, культуру поміщають на зберігання. Як середовище для кріоконсервації доцільно використовувати стерильну дефибріновану баранячу або кінську кров, середовище на основі знежиреного (знятого молока) та гліцерину, а також триптиказо-соєвий бульйон з гліцерином (прописи приготування середовищ наведені нижче).

За допомогою стерильної пластикової мікробіологічної петлі або стерильного ватяного тампона зібрати з чашки з ША або КА весь отриманий ріст, помістити його в промарковану кріопробірку з 1 мл заздалегідь прогрітого до кімнатної температури середовища для кріоконсервації, ретельно перемішати і помістити в кріоштатив. Запас еталонної культури, що рекомендується - мінімум 4 - 5 пробірок з розрахунку на кожний планований рік зберігання. Помістити кріоштатив в морозильну камеру або в судину з рідким азотом.

Закладку запасів еталонної культури на тривале зберігання здійснюють один раз на весь період її використання. Запаси еталонної культури поповненню не підлягають.

Даний блок виконує задачу накопичувача біомаси еталонного штаму, що дозволяє уникнути необхідності поповнювати запаси робочої культури за рахунок повторних пасажів еталонного штаму через поживні середовища і подовжує "термін служби" культури, отриманої з однієї ампули.

7.2.3 Створення запасів робочої культури

Кріопробірку із запасів еталонної культури виймають з морозильної камери і поміщають на сухий лід або хладоелементи, далі, забирають петлею невелику кількість середовища з культурою і проводять посів штрихом на чашку з ША та/або КА, для представників роду Streptococcus доцільний також посів і на триптиказо-соєвий або інший бульйон. Пробірку з еталонною культурою знову поміщають в морозильну камеру. Необхідно уникати повного розморожування культури в кріопробірці, що дозволяє значно продовжити термін використання еталонної частини колекції.

Посіви інкубують в 16 - 20 год. при (36 ± 1) °C, в атмосфері 5% CO2.

Один з посівів на щільному або рідкому середовищі використовують для постановки тестів на відповідність отриманого штаму типовим властивостям. Другий посів використовують для створення запасів робочої культури.

При невідповідності штаму типовим властивостям використання культури не допускається.

В цьому випадку необхідно узяти ще одну порцію еталонної культури і піддати її аналогічному дослідженню.

При задовільному проходженні тестів культуру поміщають на зберігання в середовищі для кріоконсервації згідно методу описаному в п. 7.2.2.

Зберігання колекції еталонних (контрольних) штамів, а також формування запасів робочої культури здійснюватиметься в ЦРЛ.

Запаси робочої культури створюють не рідше ніж 1 раз на 4 місяці, з розрахунку 2 пробірки з кожним контрольним штамом, що підлягає розподілу, на лабораторію і відправляють в бактеріологічні лабораторії дозорних регіонів для цільового використання. Штами призначені для контролю якості всіх лабораторних тестів і ростових якостей поживних середовищ В лабораторіях дозорних регіонів штами повинні зберігатися замороженими в середовищах для кріоконсервації (морозильна камера або рідкий азот), висіватися на відповідні середовища і використовуватися за призначенням.

Культури в середовищах для кріоконсервації повинні перевозитися в замороженому стані, що досягається використанням сухого льоду, спеціальних контейнерів і хладоелементів. Не допускається повторне заморожування і відтавання культури. Якщо матеріал при транспортуванні розморозився, то необхідно знов посіяти культуру на відповідні середовища, а потім заморозити в середовищі для кріоконсервації.

Можливі також і інші способи транспортування еталонних штамів в дозорні регіони.

8. Транспортування культур

8.1. Транспортування культур в пакетах з силікагелем

1. Отримати культуру на ША агарі (для H.influenzae, H.parainfluenzae і нейсерій) або КА (для стрептококів і нейсерій). Для цього інкубувати посів при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 протягом 18 - 20 год.

2. Перевірити чистоту культури.

3. Обробити (протерти) пакет з силікагелем 70% спиртом.

4. Розкрити пакет з силікагелем за допомогою продезінфікованих ножиць.

5. Оглянути силікагель, що знаходиться усередині пакету. Він повинен мати білий колір з голубими вкрапленнями. Наявність рожевих вкраплень указує на порушення цілісності пакету, такий силікагель не придатний до використання.

6. Зібрати стерильним сухим тампоном всю культуру з чашки.

7. Помістити тампон всередину пакету з силікагелем.

8. Переконатися, що тампон повністю занурений в силікагель.

9. Зігнути край пакету і клейкою стрічкою ретельно запечатати пакет навкруги дерев'яної рукоятки тампона.

10. Вказати на пакеті номер зразка.

11. Помістити запечатаний і промаркований пакет в пластиковий пакет з абсорбуючим матеріалом і запечатати його.

12. Транспортувати при температурі не нижче +4 °C.

13. Співробітник лабораторії, що отримав посилку, повинен розкрити пакет з силікагелем, обережно видаливши клейку стрічку, вийняти тампон і посіяти культуру на відповідне середовище (ША або КА).

14. Посів інкубують при (36 ± 1) °C або в атмосфері CO2 протягом 18 - 20 год. За наявності росту перевіряють чистоту отриманої культури. Далі культуру можна використовувати за призначенням і заморозити в середовищі для кріоконсервації для подальшого використання (методику див. п. 7.2.2).

8.2. Транспортування культур на скошеному шоколадному агарі

ША для транспортування культур розливають у флакони або пробірки з кришками, що загвинчуються і скошують.

Колонію чистої культури відповідного мікроорганізму, вирощену на чашках з ША або КА, зняти з чашки і посіяти:

S.pneumoniae - на скошену поверхню ША. Інкубувати протягом ночі при (36 ± 1) °C в атмосфері 5% CO2, після інкубації щільно закрити кришку;

H.influenzae - на скошену поверхню ША. Інкубувати протягом ночі при (36 ± 1) °C в атмосфері 5% CO2, після інкубації упевнитися, що кришка щільно закрита;

N.meningitidis на скошену поверхню ША. Інкубувати протягом ночі при (36 ± 1) °C 5% CO2. При зберіганні кришка не повинна бути щільно закрита. Під час транспортування її бажано закрити для запобігання контамінації.

Транспортують свіжі посіви при кімнатній температурі.

Одразу після отримання штамів роблять висів на ША і КА інкубують при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2, перевіряють чистоту культури і заморожують в середовищі для кріоконсервації для створення запасу робочої частини колекції. Використовують за призначенням (методику див. п. 7.2.2).

8.3. Транспортування культур на чашках Петрі з кров'яним або шоколадним агаром

Культури збудників S.pneumoniae, H.influenzae і N.meningitidis залишаються життєздатними не більше 3 - 4 днів (зберігання при кімнатній температурі). Рекомендується транспортувати свіжі посіви штамів також при кімнатній температурі. Одразу після отримання культур лабораторіями дозорних регіонів, їх необхідно пересіяти на свіжі середовища. Далі культуру можна використовувати за призначенням і заморозити в середовищі для кріоконсервації для подальшого використання (методику див. п. 7.2.2).

9. Підготовка культури для цільового використання в аналізі

За 1 - 2 дні до використання робочу культуру висівають на відповідні середовища згідно методу, наведеному в п. 7.2.3, далі використовують за призначенням.

10. Середовища для кріоконсерваціі

10.1. Дефібринована бараняча кров. Для кріоконсервації може бути безпосередньо використана стерильна дефібринована бараняча кров. Перед використанням кожної партії крові проводять тест на стерильність. Для цього повну бактеріологічну петлю крові засівають на КА, приготований з кров'ю вже перевіреної партії, а також на м'ясопептонний бульйон в співвідношенні 1:10 і інкубують при (36 ± 1) °C протягом 24 год.

Будь-який ріст повинен розглядатися, як контамінація і дана партію крові утилізують.

10.2. Середовище для кріоконсервації з 10% знятого молока / 10% гліцерину (V/V)

Змішати 10 г знятого молока (знежиреного) і 90 мл дистильованої води (флакон A).

Проавтоклавувати в окремому флаконі 10 мл гліцерину при 115 °C протягом 10 хв (флакон B).

Змішати вміст флаконів A і B відразу після автоклавування, поки рідини ще гарячі.

Отримане середовище повинне мати світло-молочний колір (не повинно бути карамелізації молока).

Розлити отриману суміш по кріопробіркам (1 мл) поки вона ще тепла.

Зберігати кріопробірки з готовим до використання середовищем при -20 °C.

Перед використанням кожної нової партії приготованого середовища його перевіряють на стерильність. Для цього повну петлю готового середовища посіяти на КА і інкубувати при (36 ± 1) °C протягом 24 год. Будь-який ріст розглядається, як контамінація і дана партія має бути утилізована.

10.3. Середовище для кріоконсервації з триптиказо-соєвого бульйону і гліцерину

Приготувати і простерилізувати 85 мл триптиказо-соєвого бульйону згідно умовам, вказаним на упаковці з сухим середовищем. Одночасно простерилізувати в окремому флаконі 15 мл гліцерину. Змішати рідини поки вони ще гарячі, остудити до 50 °C і розлити по 1 мл в кріопробірки. Готове середовище зберігати в холодильнику при 2 - 6 °C. Перед використанням кожну партію перевіряють на стерильність.

Заключне донесення про випадок бактеріального менінгіту

{Додаток 1 із змінами, внесеними згідно з Наказом Міністерства охорони здоров'я  № 38/а від 15.01.2014}

ЩОМІСЯЧНИЙ ЗВІТ
щодо захворюваності на бактеріальні менінгіти

ПАСПОРТ ШТАМУ

{Додаток 3 із змінами, внесеними згідно з Наказом Міністерства охорони здоров'я  № 38/а від 15.01.2014}

СКЛАД
робочої групи Міністерства охорони здоров'я України супроводу дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами

ПРИМІРНИЙ ПЕРЕЛІК
лікувально-профілактичних закладів, на базі яких проводиться дозорний епідеміологічний нагляд за бактеріальними менінгітами (за згодою)

{Примірний перелік із змінами, внесеними згідно з Наказом Міністерства охорони здоров'я № 38/а від 15.01.2014}

ПРИМІРНЕ ПОЛОЖЕННЯ
про Центральну референс-лабораторію з інвазивних бактеріальних захворювань ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України"

1. Загальні положення

1.1. Функції Центральної референс-лабораторії з інвазивних бактеріальних захворювань (далі - Центральна референс-лабораторія) покладаються на бактеріологічну лабораторію ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України", яка входить до мережі лабораторій, що співпрацюють з ВООЗ з питань інвазивних бактеріальних захворювань (далі - ІБЗ).

1.2. Керівником Центральної референс-лабораторії є завідуючий бактеріологічною лабораторією.

1.3. За матеріально-технічне забезпечення Центральної референс-лабораторії несе відповідальність головний лікар ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України".

1.4. Центральна референс-лабораторія здійснює спостереження за етіологічною структурою ІБЗ, циркуляцією збудників ІБЗ серед населення країни з метою прогнозування та зниження захворюваності на ІБЗ, удосконалення профілактичних і протиепідемічних заходів.

1.5. Центральна референс-лабораторія у своїй діяльності керується Конституцією України, законами України, актами Президента України та Кабінету Міністрів України, наказами МОЗ України та цим Положенням.

1.6. Референс-лабораторія утримує музей (колекцію) культур мікроорганізмів для діагностичного процесу та контролю.

1.7. Референс-лабораторія веде медичну облікову та звітну документацію у відповідності з формами, затвердженими МОЗ України.

1.8. Фінансування Референс-лабораторії здійснюється за рахунок коштів Державного бюджету України.

2. Завдання та функції Центральної референс-лабораторії з інвазивних бактеріальних захворювань

2.1. Здійснення методичного керівництва і надання практичної допомоги мережі лабораторій установ та закладів охорони здоров'я з питань бактеріологічної діагностики ІБЗ.

2.2. Проведення аналізу матеріалів державної статистичної та галузевої звітності, інформацій, що надходять до МОЗ України та ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України" від установ охорони здоров'я щодо об'єму, структури та результатів бактеріологічних досліджень на ІБЗ.

2.3. Надання консультацій щодо методів бактеріологічної діагностики ІБЗ, включаючи ідентифікацію збудників, серотипування/серогрупування, визначення чутливості до антибіотиків та проведення молекулярно-генетичних досліджень.

2.4. Збір і вивчення біологічних властивостей збудників ІБЗ, що циркулюють на території країни.

2.5. Створення Національної колекції збудників ІБЗ, що циркулюють на території країни.

2.6. Розробка, апробація і впровадження в практику нових лабораторних технологій, методів, методик досліджень, що стосуються індикації та ідентифікації збудників ІБЗ.

2.7. Апробація і впровадження в практику нових медичних виробів, що використовуються для виявлення та ідентифікації збудників ІБЗ.

2.8. Підготовка інформаційних матеріалів з питань етіологічної структури, методів дослідження та сучасних досягнень в галузі мікробіологічної діагностики ІБЗ.

2.9. Організація підготовки лікарів-бактеріологів з питань сучасних методів лабораторної діагностики ІБЗ.

2.10. Організація та проведення контролю якості бактеріологічних досліджень шляхом надання контрольних "імітаційних" задач та підтвердження виділених культур.

2.11. Участь в системі міжнародного контролю якості досліджень, що проводиться ВООЗ.

2.12. Співробітництво з Регіональною референс-лабораторією ВООЗ з ІБЗ (м. Москва, Російська Федерація).

2.13. Участь в міжнародних програмах з мікробіологічного контролю за ІБЗ в Європейському регіоні.

3. Права Центральної референс-лабораторії з діагностики інвазивних бактеріальних захворювань

3.1. Проводити весь комплекс досліджень з мікробіологічної діагностики ІБЗ матеріалу, що надходить.

3.2. Користуватися інформацією, що надходить до МОЗ України, Держсанепідслужби України та ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України" від установ охорони здоров'я, що необхідна для аналізу етіологічної структури, біологічних особливостей збудників ІБЗ, а також для оцінки ефективності профілактичних, протиепідемічних заходів, лабораторних досліджень.

3.3. Одержувати від установ охорони здоров'я культури збудників ІБЗ, зразки діагностичного матеріалу для підтвердження та подальшого вивчення.

3.4. Вносити на розгляд МОЗ України пропозиції з питань поліпшення лабораторної діагностики ІБЗ.

3.5. Перевіряти якість роботи лабораторій установ охорони здоров'я системи МОЗ України з лабораторної діагностики ІБЗ.

3.6. Брати участь у роботі по підвищенню кваліфікації фахівців лабораторій з розділу "Бактеріологічна діагностика ІБЗ".

3.7. Брати участь у підготовці та виданні матеріалів наукового, інформаційного, методичного та просвітницького спрямування з питань лабораторної діагностики ІБЗ, етіологічної структури ІБЗ та циркуляції збудників серед населення.

3.8. Брати участь в системі міжнародного контролю якості досліджень щодо збудників ІБЗ.

3.9. Співпрацювати з Регіональною референс-лабораторією з діагностики ІБЗ ВООЗ.

3.10. Брати участь в міжнародних програмах по мікробіологічному контролю за ІБЗ в Європейському регіоні.

3.11. Брати участь в організації та проведенні науково-практичних конференцій, з'їздів, семінарів, нарад стосовно лабораторної діагностики ІБЗ, в тому числі міжнародних.

4. Взаємодія

4.1. Центральна референс-лабораторія здійснює свою роботу у взаємодії із закладами охорони здоров'я, Головними управліннями та лабораторними центрами Держсанепідслужби України, профільними науково-дослідними інститутами Міністерства охорони здоров'я України та Національної Академії медичних наук України, профільними кафедрами вищих навчальних медичних закладів III - IV рівнів акредитації.

4.2. Центральна референс-лабораторія взаємодіє міжнародними організаціями - ВООЗ, ЮНІСЕФ тощо з питань нагляду за ІБЗ в установленому порядку.

4.3. Центральна референс-лабораторія взаємодіє з аналогічним центрами та референс-лабораторіями зарубіжних країн в установленому порядку.

5. Припинення діяльності

5.1. Припинення діяльності Центральної референс-лабораторії проводиться за рішенням МОЗ України в установленому законодавством порядку.