Про організацію роботи вірусологічних лабораторій щодо моніторингу ентеровірусів, в тому числі поліовірусів

Відповідно до статей 6, 11 Закону України "Про захист населення від інфекційних хвороб", керуючись пунктом 9 Положення про Державну санітарно-епідеміологічну службу України, затвердженого Указом Президента України від 06.04.2011 № 400, враховуючи ускладнену епідемічну ситуацію з поліомієліту в Україні та з метою організації роботи вірусологічних лабораторій щодо моніторингу ентеровірусів, в тому числі поліовірусів, НАКАЗУЮ:

1. Затвердити примірні стандартні операційні процедури з відбору, доставки, прийому, обробки та підготовки проб довкілля та біологічного матеріалу для виділення ентеровірусів, в тому числі поліовірусів (далі - Примірні стандартні операційні процедури), що додаються:

Примірна стандартна операційна процедура з обробки проб води поверхневих водойм для виділення проб води поверхневих водойм для виділення ентеровірусів, в тому числі поліовірусів;

Примірна стандартна операційна процедура з відбору і доставки проб поверхневих водойм для виділення ентеровірусів, в числі поліовірусів;

Примірна стандартна операційна процедура з обробки проб стічної води для виділення ентеровірусів, в тому числі поліовірусів;

Примірна стандартна операційна процедура з відбору і доставки проб спинно-мозкової рідини для виділення ентеровірусів, в тому числі поліовірусів;

Примірна стандартна операційна процедура з відбору і доставки проб сироватки крові для виділення ентеровірусів, в тому числі поліовірусів;

Примірна стандартна операційна процедура з підготовки назофарингіального змиву до виділення ентеровірусів, в тому числі поліовірусів;

Примірна стандартна операційна процедура з обробки проб питної води (РЧВ) для виділення ентеровірусів, в тому числі поліовірусів;

Примірна стандартна операційна процедура з відбору і доставки проб питної води для виділення ентеровірусів, в тому числі поліовірусів;

Примірна стандартна операційна процедура з підготовки проб фекалій до виділення ентеровірусів, в тому числі поліовірусів;

Примірна стандартна операційна процедура з відбору, доставки та прийому проб фекалій від контактних осіб для виділення ентеровірусів, в тому числі поліовірусів;

Примірна стандартна операційна процедура з відбору і доставки проб назофарингеальних змивів для виділення ентеровірусів, в тому числі поліовірусів;

Примірна стандартна операційна процедура з виділенням поліовірусів та інших ентеровірусів на культурі клітин;

Примірна стандартна операційна процедура з пасажування та підтримки культури L20b;

Стандартна операційна процедура з підготовки секційних проб до виділення ентеровірусів, в тому числі поліовірусів;

Примірна стандартна операційна процедура з пасажування та підтримки культури RD.

2. Керівникам державних установ, що входять до сфери управління Держсанепідслужби України:

2.1. у термін до 19 лютого 2016 року розробити та затвердити відповідні стандартні операційні процедури;

2.2. інформацію про затвердження стандартних операційних процедур надати до Управління соціально-гігієнічного моніторингу та аналізу ризиків Держсанепідслужби України (Фенюк О.В.) до 25 лютого 2016 року.

3. Контроль за виконанням цього наказу залишаю за собою.

ПРИМІРНА СТАНДАРТНА ОПЕРАЦІЙНА ПРОЦЕДУРА
З ОБРОБКИ ПРОБ ВОДИ ПОВЕРХНЕВИХ ВОДОЙМ ДЛЯ ВИДІЛЕННЯ ЕНТЕРОВІРУСІВ, В ТОМУ ЧИСЛІ ПОЛІОВІРУСІВ

1. З доставленої проби відбираємо 2 л зразка поверхневої води.

2. За допомогою pH-метра вимірюємо pH води при кімнатній температурі.

3. Доводимо pH до 5,0 за допомогою розчинів 1M HCl або NaOH.

4. До проби додаємо 4 г ентеросгелю.

5. Ретельно змішуємо та залишаємо відстоюватися в холодильнику на 24 год.

6. На наступний день зливаємо надосад, а осад, що утворився розливаємо у флакони чи центрифужні пробірки.

7. Центрифугуємо 20 хв. при 2000 об/хв.

8. Переливаємо надосад у флакон (4 мл) та перевіряємо pH. Спочатку доводимо pH до 7,0-7,2 і розливаємо в 2 мікропробірки по 500 мкл для проведення ІФА на ВГА та RV. Пробірки підписуємо відповідними номерами та кладемо в морозильну камеру (-20° C). У залишку елюату (3 мл) доводимо pH до 5,0.

9. У пеніциліновий флакон з елюатом додаємо 150 мкл хлороформу (з розрахунку 500 мкл хлороформу на 10 мл води).

10. Струшуємо та залишаємо на 30 хв. при кімнатній температурі.

11. Центрифугуємо 20 хв. при 2000 об/хв.

12. У боксі ОБЕРЕЖНО піпеткою (не торкаючись кульки хлороформу) переносимо надосад у стерильний пеніциліновий флакончик та зберігаємо в морозильній камері.

13. Заражаємо культуру клітин.

ПРИМІРНА СТАНДАРТНА ОПЕРАЦІЙНА ПРОЦЕДУРА
З ВІДБОРУ І ДОСТАВКИ ПРОБ ПОВЕРХНЕВИХ ВОДОЙМ ДЛЯ ВИДІЛЕННЯ ЕНТЕРОВІРУСОВ, В ТОМУ ЧИСЛІ ПОЛІОВІРУСІВ

1. Проби відбираються тільки у стерильний посуд, роботу проводять в халаті та гумових рукавичках, ємність з матеріалом закривають щільно гумовими корками, обклеюють лейкопластиром.

2. Вода поверхневих водойм об'ємом 3,0 л відбирається з мостів, помостів, плавзасобів за допомогою батометра з глибини 10-15 см від поверхні води.

3. Проби маркують, вказують населений пункт, точку відбору, назву проби, дату (число, місяць, рік) відбору. До проби додається направлення зразка.

4. Зразки доставляються у вірусологічну лабораторію ДУ "Обласний лабораторний центр Держсанепідслужби України" у сумках-холодильниках, або у пінопластових коробках з сухим або вологим льодом в максимально короткі терміни (не більше 6-ти годин).

5. Після отримання проби працівники лабораторії негайно розпаковують її в визначеному для цього місті, де є ємність для сміття, тампони з спиртом і паперові рушники.

6. Розпаковують матеріал 2 працівники, один з яких працює в рукавичках, перевіряє цілісність і герметичність проби, а інший проводить реєстрацію зразка.

7. Інформацію на етикетці проби звіряють з записами в бланку направлення. Кожній пробі присвоюється реєстраційний номер, який вноситься в журнал реєстрації та в направлення від проби. Цей номер ставлять на ємкостях з пробою, і надалі він проставляється на всіх ємкостях з цією пробою при всіх маніпуляціях в лабораторії.

8. В лабораторії вода підлягає дослідженню в перші години з моменту надходження. При необхідності її можна зберігати при температурі +4° C протягом доби, а при температурі 20° C і більш тривалий час.

ПРИМІРНА СТАНДАРТНА ОПЕРАЦІЙНА ПРОЦЕДУРА
З ОБРОБКИ ПРОБ СТІЧНОЇ ВОДИ ДЛЯ ВИДІЛЕННЯ ЕНТЕРОВІРУСІВ, В ТОМУ ЧИСЛІ ПОЛІОВІРУСІВ

1. З доставленої проби відбираємо 1 л зразка стічної води.

2. За допомогою pH-метра вимірюємо pH води при кімнатній температурі.

3. Доводимо pH до 5,0 за допомогою розчинів 1M HCl або NaOH.

4. До проби додаємо 1 г ентеросгелю.

5. Ретельно змішуємо та залишаємо відстоюватися в холодильнику на 24 год.

6. На наступний день зливаємо 1ад осад, а осад, що утворився розливаємо у флакони чи центрифужні пробірки.

7. Центрифугуємо 20 хв при 2000 об/3ад.

8. Переливаємо 3ад осад у флакон (4 мл) та перевіряємо pH. Спочатку доводимо pH до 7,0-7,2 і розливаємо в 2 мікропробірки по 500 мкл для проведення ІФА на ВГА та RV. Пробірки підписуємо відповідними номерами та кладемо в морозильну камеру(-20° C).

9. У пеніциліновий флакон з елюатом додаємо 150 мкл хлороформу (з розрахунку 500 мкл хлороформу на 10 мл води).

10. Струшуємо та залишаємо на 30 хв при кімнатній температурі.

11. Центрифугуємо 20 хв. при 2000 об/4ад.

12. У боксі ОБЕРЕЖНО піпеткою (не торкаючись кульки хлороформу) переносимо 4ад осад у стерильний пеніциліновий флакончик та зберігаємо в морозильній камері.

13. Заражаємо культуру клітин.

ПРИМІРНА СТАНДАРТНА ОПЕРАЦІЙНА ПРОЦЕДУРА
З ВІДБОРУ І ДОСТАВКИ ПРОБ СПИННО-МОЗКОВОЇ РІДИНИ ДЛЯ ВИДІЛЕННЯ ЕНТЕРОВІРУСІВ, В ТОМУ ЧИСЛІ ПОЛІОВІРУСІВ

1. Спинно-мозкова рідина відбирається стерильно в кількості 2-3 мл в стерильну пробірку.

2. Зразки нумерують, обгортають гігроскопічним матеріалом, поміщають в пластиковий пакет та заклеюють. Матеріал поміщається в контейнер для транспортування з холодовим елементом.

3. У направленні на дослідження вказується номер зразку, ПІБ, вік, стать, адреса хворого, дата останньої вакцинації від поліомієліту, серія використаної вакцини та термін її придатності, дата захворювання, діагноз або клінічні прояви, дата відбору матеріалу, підпис та прізвище відповідальної особи. Направлення поміщається у файл, а потім в контейнер для транспортування.

4. Матеріал доставляється у вірусологічну лабораторію ДУ "Обласний лабораторний центр Держсанепідслужби України" (адреса) в день відбору, якщо це не можливо, то не пізніше 48-72 год (зберігається матеріал у морозильній камері при температурі -18°С; -20°C).

5. Після отримання проби працівники лабораторії негайно розпаковують її у визначеному для цього місці, де є ємність для сміття, тампони з спиртом і паперові рушники.

6. Розпаковують матеріал два працівники, один з яких працює в рукавичках, перевіряє цілісність і герметичність проби, а інший проводить реєстрацію зразка.

7. Інформацію на етикетці проби звіряють з записами в бланку направлення. Кожній пробі присвоюється реєстраційний номер, який вноситься в журнал реєстрації та в направлення від проби. Цей номер ставлять на ємкостях з пробою, і надалі він проставляється на всіх ємкостях з цією пробою при всіх маніпуляціях в лабораторії.

8. В лабораторії проба підлягає дослідженню в перші години з моменту надходження. При необхідності її можна зберігати при температурі +4° C протягом доби, а при температурі -20° C і тривалий час.

ПРИМІРНА СТАНДАРТНА ОПЕРАЦІЙНА ПРОЦЕДУРА
З ВІДБОРУ І ДОСТАВКИ ПРОБ СИРОВАТКИ КРОВІ ДЛЯ ВИДІЛЕННЯ ЕНТЕРОВІРУСІВ, В ТОМУ ЧИСЛІ ПОЛІОВІРУСІВ

1. Сироватка крові відбирається двічі стерильно в кількості 0,3 мл в стерильний епендорф. Перша проба відбирається в перші 7 днів захворювання, друга - на 21-28 день захворювання.

2. Зразки нумерують, обгортають гігроскопічним матеріалом, поміщають в пластиковий пакет та заклеюють. Матеріал поміщається в контейнер для транспортування з холодовим елементом.

3. У направленні на дослідження вказується номер зразку, П.І.Б/, вік, стать, адреса хворого, дата останньої вакцинації від поліомієліту, серія використаної вакцини та термін її придатності, дата захворювання, діагноз або клінічні прояви, дата відбору матеріалу, підпис та прізвище відповідальної особи. Направлення вкладається у файл, а потім - в контейнер для транспортування.

4. Матеріал доставляється у вірусологічну лабораторію ДУ "Обласний лабораторний центр Держсанепідслужби України" (адреса) в день відбору, якщо це неможливо, то зберігається у морозильній камері при температурі -18° C, -20° C не більше 48-72 год.

5. Після отримання проби працівники лабораторії негайно розпаковують її у визначеному для цього місці, де є ємність для сміття, тампони з спиртом і паперові рушники.

6. Розпаковують матеріал два працівники, один з яких працює в рукавичках, перевіряє цілісність і герметичність проби, а інший проводить реєстрацію зразків.

7. Інформацію на етикетці проби звіряють із записами в бланку направлення. Кожній пробі присвоюється реєстраційний номер, який вноситься в журнал реєстрації та в направлення відповідної проби. Цей номер ставлять на ємкостях з пробою, і надалі він проставляється на всіх ємкостях з цією пробою при всіх маніпуляціях в лабораторії.

8. В лабораторії матеріал підлягає дослідженню в перші години з моменту надходження. В разі необхідності його можна зберігати при температурі +4° C протягом доби, а при температурі -20° C і тривалий час.

ПРИМІРНА СТАНДАРТНА ОПЕРАЦІЙНА ПРОЦЕДУРА
З ПІДГОТОВКИ НАЗОФАРИНГІАЛЬНОГО ЗМИВУ ДО ВИДІЛЕННЯ ЕНТЕРОВІРУСІВ, В ТОМУ ЧИСЛІ ПОЛІОВІРУСІВ

1. Ретельно струшуємо пробірку чи флакон з тампоном, зануреним у вірусну транспортну рідину.

2. Стерильним пінцетом щільно віджимаємо тампон по стінці пробірки (флакона) і викидаємо.

3. Переносимо рідину у два флакони з підписом.

4. Додаємо антибіотики (100 МЕ/мл пеніциліна і 100 мкг/мл стрептоміцина).

5. Один флакон залишаємо для зберігання при -20° C, інший використовують для дослідження на культурі клітин поміщаємо в холодильник при температурі 0 - +8° C.

ПРИМІРНА СТАНДАРТНА ОПЕРАЦІЙНА ПРОЦЕДУРА
З ОБРОБКИ ПРОБ ПИТНОЇ ВОДИ (РЧВ) ДЛЯ ВИДІЛЕННЯ ЕНТЕРОВІРУСІВ, В ТОМУ ЧИСЛІ ПОЛІОВІРУСІВ

1. З доставленої проби відбираємо 10 л зразка питної води.

2. За допомогою pH-метра вимірюємо pH води при кімнатній температурі.

3. Доводимо pH до 5,0 за допомогою розчинів 1М HCl або NaOH.

4. До проби додаємо 20 г. ентеросгелю.

5. Ретельно змішуємо та залишаємо відстоюватися в холодильнику на 24 год.

6. На наступний день зливаємо надосад, а осад, що утворився розливаємо у флакони чи центрифужні пробірки.

7. Центрифугуємо 20 хв. при 2000 об/хв.

8. Переливаємо надосад у флакон (4 мл) та перевіряємо pH. Спочатку доводимо pH до 7,0-7,2 і розливаємо в 2 мікропробірки по 500 мкл для проведення ІФА на ВГА та RV. Пробірки підписуємо відповідними номерами та кладемо в морозильну камеру.

9. У пеніциліновий флакон з елюатом додаємо 150 мкл хлороформу (з розрахунку 500 мкл хлороформу на 10 мл води).

10. Струшуємо та залишаємо на 30 хв. при кімнатній температурі.

11. Центрифугуємо 20 хв. при 2000 об/хв.

12. У боксі "ОБЕРЕЖНО" піпеткою (не торкаючись кульки хлороформу) переносимо надосад у стерильний пеніциліновий флакончик та зберігаємо в морозилці.

13. Заражаємо культуру клітин.

ПРИМІРНА СТАНДАРТНА ОПЕРАЦІЙНА ПРОЦЕДУРА
З ВІДБОРУ І ДОСТАВКИ ПРОБ ПИТНОЇ ВОДИ ДЛЯ ВИДІЛЕННЯ ЕНТЕРОВІРУСІВ, В ТОМУ ЧИСЛІ ПОЛІОВІРУСІВ

1. Проби відбираються тільки у стерильний посуд, роботу проводять в халаті та гумових рукавичках, ємність з матеріалом закривають щільно гумовими корками, обклеюють лейкопластиром.

2. Питна вода відбирається (за епідпоказаннями) в об'ємі 10 літрів. Перед відбором проб кран тричі фламбують запаленим спиртовим факелом і спускають воду протягом 10-15 хвилин при повністю відкритому крані. Для нейтралізації залишку хлору в посуд для відбору проб перед стерилізацією додають гіпосульфіт натрію з розрахунку 20 мг на 10 л води.

3. Проби маркують, вказують населений пункт, точку відбору, назву проби, дату (число, місяць, рік) відбору. До проби додається направлення зразка.

4. Зразки доставляються у вірусологічну лабораторію ДУ "Обласний лабораторний центр Держсанепідслужби України" в сумках-холодильниках, або у пінопластових коробках з сухим або вологим льодом в максимально короткі терміни (не більше 6-ти годин).

5. Після отримання проби працівники лабораторії негайно розпаковують її в визначеному для цього місті, де є ємність для сміття, тампони з спиртом і паперові рушники.

6. Розпаковують матеріал 2 працівника, один з яких працює в рукавичках, перевіряє цілісність і герметичність проби, а інший проводить реєстрацію зразка.

7. Інформацію на етикетці проби звіряють з записами в бланку направлення. Кожній пробі присвоюється реєстраційний номер, який вноситься в журнал реєстрації та в направлення від проби. Цей номер ставлять на ємкостях з пробою, і надалі він проставляється на всіх ємкостях з цією пробою при всіх маніпуляціях в лабораторії.

8. В лабораторії вода підлягає дослідженню в перші години з моменту надходження. При необхідності її можна зберігати при температурі +4° C протягом доби, а при температурі - 20° C і довше.

ПРИМІРНА СТАНДАРТНА ОПЕРАЦІЙНА ПРОЦЕДУРА
З ПІДГОТОВКИ ПРОБ ФЕКАЛІЙ ДО ВИДІЛЕННЯ ЕНТЕРОВІРУСІВ, В ТОМУ ЧИСЛІ ПОЛІОВІРУСІВ

1. Маркуємо центрифужну пробірку проби.

2. Наливаємо в пробірку 10 мл ФСБ, додаємо 5 г скляних горошин і 0,5 мл хлороформу.

3. Вносимо близько 2 г фекальної проби.

4. Щільно закриваємо центрифужну пробірку і струшуємо протягом 20 хв.

5. Центрифугуємо з охолодженням протягом 20 хв. при 1500 g.

6. Надосад кожної проби переносимо у два флакони з підписом. Якщо рідина залишилась непрозорою, повторюємо обробку хлороформом.

7. Один флакон залишаємо на зберігання при -20° C, інший використовують для дослідження на культурі клітин або поміщаємо в холодильник при температурі 0 - +8° C.

ПРИМІРНА СТАНДАРТНА ОПЕРАЦІЙНА ПРОЦЕДУРА
З ВІДБОРУ, ДОСТАВКИ ТА ПРИЙОМУ ПРОБ ФЕКАЛІЙ ВІД КОНТАКТНИХ ОСІБ ДЛЯ ВИДІЛЕННЯ ЕНТЕРОВІРУСІВ, В ТОМУ ЧИСЛІ ПОЛІОВІРУСІВ

1. Зразки фекалій відбирають одноразово (1 проба) у стерильну одноразову посудину для калу в кількості 8 гр.

2. Зразки нумерують, обгортають гігроскопічним матеріалом, поміщають в пластиковий пакет та заклеюють. Матеріал поміщається в контейнер для транспортування з холодовим елементом.

3. У направленні на дослідження вказується номер зразку, П.І.Б., вік, стать, адреса контактної особи, дата останньої вакцинації від поліомієліту, серія використаної вакцини та термін її придатності, дата захворювання, діагноз або клінічні прояви, дата відбору матеріалу, підпис та прізвище відповідальної особи. Для проб контактних осіб слід присвоїти той же реєстраційний номер, що і хворому, тільки вкінці додавати номер С1 для першої особи, С2 для другої особи тощо. Направлення поміщається у файл, далі в контейнер для транспортування.

4. Матеріал доставляється у вірусологічну лабораторію ДУ "Обласний лабораторний центр Держсанепідслужби України" (адреса установи) у сумках-холодильниках, або у пінопластових коробках з сухим, або вологим льодом в день відбору, якщо це не можливо, то не пізніше 48-72 год. (зберігається матеріал у морозильній камері при Т -18°C - -20° C).

5. Після отримання проби працівники лабораторії негайно розпаковують її у визначеному для цього місці, де є ємність для сміття, тампони з спиртом і паперові рушники.

6. Розпаковують матеріал два працівники, один з яких працює в рукавичках, перевіряє цілісність і герметичність проби, а інший проводить реєстрацію зразка.

7. Інформацію на етикетці проби звіряють з записами в бланку направлення. Кожній пробі присвоюється епідномер, який вноситься в журнал реєстрації та в направлення від проби. Цей номер ставлять на ємкостях з пробою, і надалі він проставляється на всіх ємкостях з цією пробою при всіх маніпуляціях в лабораторії.

8. У лабораторії проба підлягає дослідженню в перші години з моменту надходження. При необхідності її можна зберігати при температурі +4° C протягом доби, а при температурі -20° C і довше.

ПРИМІРНА СТАНДАРТНА ОПЕРАЦІЙНА ПРОЦЕДУРА
З ВІДБОРУ І ДОСТАВКИ ПРОБ НАЗОФАРИНГЕАЛЬНИХ ЗМИВІВ ДЛЯ ВИДІЛЕННЯ ЕНТЕРОВІРУСІВ, В ТОМУ ЧИСЛІ ПОЛІОВІРУСІВ

1. Глоточний мазок відбирають в перші 3 дні захворювання сухим стерильним тампоном із задньої стінки глотки, мигдальних дужок, занурюють у стерильну пробірку з 2 мл розчину Хенксу або фізіологічного розчину з pH 7,0-7,2.

2. Зразки нумерують, обгортають гігроскопічним матеріалом, поміщають в пластиковий пакет та заклеюють. Матеріал поміщається в контейнер для транспортування з холодовим елементом.

3. У направленні на дослідження вказується номер зразку, П.І.Б., вік, стать, адреса хворого, дата останньої вакцинації від поліомієліту, серія використаної вакцини та термін її придатності, дата захворювання, діагноз або клінічні прояви, дата відбору матеріалу, підпис та прізвище відповідальної особи. Направлення поміщається у файл, а потім - в контейнер для транспортування.

4. Матеріал доставляється у вірусологічну лабораторію ДУ "Обласний лабораторний центр Держсанепідслужби України" (адреса) в день відбору, якщо це не можливо, то не пізніше 48-72 год. (тривало матеріал зберігають у морозильнику при температурі -18° - -20°C).

5. Після отримання проби працівники лабораторії негайно розпаковують її в визначеному для цього місті, де є ємність для сміття, тампони з спиртом і паперові рушники.

6. Розпаковують матеріал два працівники, один з яких працює в рукавичках, перевіряє цілісність і герметичність проби, а інший проводить реєстрацію зразка.

7. Інформацію на етикетці проби звіряють із записами в бланку направлення. Кожній пробі присвоюється реєстраційний номер, який вноситься в журнал реєстрації та в направлення від проби. Цей номер ставлять на ємкостях з пробою, і надалі він проставляється на всіх ємкостях з цією пробою при всіх маніпуляціях в лабораторії.

8. В лабораторії матеріал підлягає дослідженню в перші дні із моменту надходження. У разі необхідності, можна зберігати при температурі +4° C протягом доби, а при температурі -20° C і довше.

ПРИМІРНА СТАНДАРТНА ОПЕРАЦІЙНА ПРОЦЕДУРА
З ВИДІЛЕННЯМ ПОЛІОВІРУСІВ ТА ІНШИХ ЕНТЕРОВІРУСІВ НА КУЛЬТУРІ КЛІТИН

1. Обробити передбоксну кімнату та бокс бактерицидною лампою 15-20 хв. Входити до боксу після стерилізації не раніше 10-15 хв.

2. В передбоксовій кімнаті персонал миє руки, одягає стерильний одяг (халат, шапочку, маску, гумові рукавички, медичний костюм, бахіли).

3. Культури із свіжоутвореним моношаром мікроскопіюють для перевірки стану клітин.

4. Маркують дві пробірки з клітинами RD та дві пробірки клітинами L20B для дослідження кожної проби (номер проби, дата, номер пасажу).

5. Маркують по одній пробірці з кожним типом клітин для контролю.

6. Видаляємо ростове середовище і заміняємо його на 1 мл підтримуючого середовища.

7. Вносимо в кожну пробірку 0,2 мл екстракту проби і поміщаємо під кутом 5° в термостат при 36° C.

8. Щодня перевіряємо культуру на виявлення ЦПД.

9. Всі ознаки ЦПД (від 1+ до 4+), токсичності, дегенерації чи контамінації побічними мікроорганізмами реєструють протягом тижня (або більше), як в заражених, так і в контрольних культурах.

10. Якщо наявні характерні ознаки для ентеровірусів ЦПД (округлі світлі клітини, відділені від поверхні скла), реєструють зміни, продовжують спостерігати до змін моношару клітин, що становить 75 % (3+), а потім зберігають культуральну рідину при температурі -20° C для подальших досліджень.

11. При відсутності змін культури, спостерігають не менше 14 днів, а потім знищують.

ПРИМІРНА СТАНДАРТНА ОПЕРАЦІЙНА ПРОЦЕДУРА
З ПАСАЖУВАННЯ ТА ПІДТРИМКИ КУЛЬТУРИ L20b

1. Обробляємо передбоксну кімнату та бокс бактерицидною лампою 15-20 хв. Входити в бокс після обробки не раніше 10-15 хв.

2. В передбоксовій кімнаті персонал миє руки, одягає стерильний одяг (халат, шапочку, маску, гумові рукавички, медичний костюм, бахіли).

3. Всі розчини (розчин Версену, трипсину, ростове середовище) при роботі з культурою повинні бути теплими.

4. Всі матеріали (флакони, пробірки, піпетки, матраси) повинні бути стерильними.

5. Зливаємо ростове середовище з флакона з культурою клітин і обережно обполіскуємо моношар клітин ФСБ.

6. У флакон вносимо 0,25 % розчин трипсину (або у рівному співвідношенні 0,25 % трипсину і 1:5000 розчину версену) у ФСБ. У флакон з культуральною поверхнею 25 см 2 достатньо 0,5 мл розчину. Його рівномірно розподіляють по моношару клітин невеликим покачуванням флакону.

7. Витримуємо флакон при 36° C доки всі клітини не відділяться від ростової поверхні (перевіряють під мікроскопом). Рекомендується активно постукати декілька разів по стінці флакона.

8. Клітини ресуспендуємо в ростовому середовищі (4,5 мл на флакон з ростовим моношаром 25 см2), що гальмує дію трипсину. Суспензію пікетують через тонку піпетку, щоб розбити агрегати клітин.

9. Розводимо суспензію клітин ростовим середовищем до потрібної концентрації, опираючись на підрахунки клітин, або використовуючи розведення 1:3 (або більш високе, відповідно практиці роботи з даними клітинами).

10. Розсіваємо отриману клітинну суспензію в культуральні флакони або пробірки, щільно закриваємо, вказуємо тип клітин, номер та дату пасажу і поміщаємо в термостат при 36° C.

11. Коли моношар буде майже сформований (2-3 дні), змінюємо ростове середовище на середовище підтримки. Культури зазвичай перевивають кожні 5-7 днів.

СТАНДАРТНА ОПЕРАЦІЙНА ПРОЦЕДУРА
З ПІДГОТОВКИ СЕКЦІЙНИХ ПРОБ ДО ВИДІЛЕННЯ ЕНТЕРОВІРУСІВ, В ТОМУ ЧИСЛІ ПОЛІОВІРУСІВ

1. Готуємо 10% екстракт кожної проби тканин у ФСБ з антибіотиками, гомогенізуємо тканину в подрібнювачі або ступці із стерильним піском.

2. Переносимо рідину в центрифужну пробірку і центрифугуємо протягом 10 хв. при 500g.

3. Розливаємо 10ад осад у два флакони з підписом.

4. Один флакон залишаємо для зберігання при -20° C, інший використовуємо для дослідження на культурі клітин або поміщаємо в холодильник при температурі 0 - +8° C.

ПРИМІРНА СТАНДАРТНА ОПЕРАЦІЙНА ПРОЦЕДУРА
З ПАСАЖУВАННЯ ТА ПІДТРИМКИ КУЛЬТУРИ RD

1. Обробляємо передбоксну кімнату та бокс бактерицидною лампою 15-20 хв. Входити в бокс після обробки не раніше 10-15 хв.

2. В передбоксовій кімнаті персонал миє руки, одягає стерильний одяг (халат, шапочку, маску, гумові рукавички, медичний костюм, бахіли).

3. Всі розчини (розчин Версену, трипсину, ростове середовище) при роботі з культурою повинні бути теплими.

4. Всі матеріали (пробірки, піпетки, флакони, матраси) повинні бути стерильними.

5. Зливаємо ростове середовище з флакона з культурою клітин і обережно обполіскуємо моношар клітин ФСБ.

6. У флакон вносимо 0,25 % розчин трипсину (або у рівному співвідношенні 0,25 % трипсину і 1:5000 розчину версену) у ФСБ. У флакон з культуральною поверхнею 25 см2 достатньо 0,5 мл розчину. Його рівномірно розподіляють по моношару клітин невеликим покачуванням флакону.

7. Витримуємо флакон при 36° C доки всі клітини не відділяться від ростової поверхні (перевіряють під мікроскопом). Рекомендується активно постукати декілька разів по стінці флакона.

8. Клітини ресуспендуємо в ростовому середовищі (4,5 мл на флакон з ростовим моношаром 25 см2), що гальмує дію трипсину. Суспензію пікетують через тонку піпетку, щоб розбити агрегати клітин.

9. Розводимо суспензію клітин ростовим середовищем до потрібної концентрації, опираючись на підрахунки клітин, або використовуючи розведення 1:3 (або більш високе, відповідно практиці роботи з даними клітинами).

10. Розсіваємо отриману клітинну суспензію в культуральні флакони або пробірки, щільно закриваємо, вказуємо тип клітин, номер та дату пасажу і поміщаємо в термостат при 36° C.

11. Коли моношар буде майже сформований (2-3 дні), змінюємо ростове середовище на середовище підтримки. Культури зазвичай перевивають кожні 5-7 днів.

ПРИМІРНА СТАНДАРТНА ОПЕРАЦІЙНА ПРОЦЕДУРА
З ВІДБОРУ І ДОСТАВКИ ПРОБ СТІЧНОЇ ВОДИ ДЛЯ ВИДІЛЕННЯ ЕНТЕРОВІРУСОВ, В ТОМУ ЧИСЛІ ПОЛІОВІРУСІВ

1. Проби відбираються тільки у стерильний посуд, роботу проводять в халаті та гумових рукавичках, ємність з матеріалом закривають щільно гумовими корками, обклеюють лейкопластиром.

2. Стічна вода об'ємом 1,0 л відбирається за допомогою батометра у дві стерильні скляні посудини, які заповнюються на 2/3 об'єму.

3. Проби маркують, вказують населений пункт, точку відбору, назву проби, дату (число, місяць, рік) відбору. До проби додається направлення зразка.

4. Зразки доставляються у вірусологічну лабораторію ДУ "Обласний лабораторний центр ДСЕСУ" в сумках-холодильниках, або у пінопластових коробках з сухим або вологим льодом у максимально короткі терміни (не більше 6-ти годин).

5. Після отримання проби працівники лабораторії негайно розпаковують її у визначеному для цього місці, де є ємність для сміття, тампони з спиртом і паперові рушники.

6. Розпаковують матеріал 2 працівники, один з яких працює в рукавичках, перевіряє цілісність і герметичність проби, а інший проводить реєстрацію зразка.

7. Інформацію на етикетці проби звіряють з записами в бланку направлення. Кожній пробі присвоюється реєстраційний номер, який вноситься в журнал реєстрації та в направлення від проби. Цей номер ставлять на ємкостях з пробою, і надалі він проставляється на всіх ємкостях з цією пробою при всіх маніпуляціях в лабораторії.

8. В лабораторії вода підлягає дослідженню в перші години з моменту надходження. При необхідності її можна зберігати при температурі +4° C протягом доби, а при температурі 20° C і більш тривалий час.

{Текст взято з сайту Держсанепідслужби України http://www.dsesu.gov.ua}