Про затвердження методичних вказівок з мікробіологічної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів
{Із змінами, внесеними згідно з Наказом Міністерства охорони здоров'я
№ 2415 від 03.11.2021}
Гнійні бактеріальні менінгіти (ГБМ) - група важких інфекційних захворювань, що поширені всюди. Захворюваність на менінгококову інфекцію й інші види ГБМ в Україні сягає 2000 випадків на рік при летальності до 14%. Основними збудниками ГБМ є бактерії видів Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae. Відносний внесок того або іншого виду бактерій у захворюваність ГБМ залежить від багатьох факторів: епідемічної ситуації, регіону, вікової групи хворих та інших. У ході багаторічного (2000-2003 р.р.) спостереження встановлено, що близько 30% випадків ГБМ в країні були менінгококової етіології (N. meningitidis), 6% - пневмококової етіології (S. pneumoniae), 2% випадків були викликані гемофільною паличкою типу b (Haemophilus influenzae типу b або Hib) і 16% - іншими бактеріями. Біля 46% захворювань залишаються нерозшифрованими.
Згідно з результатами експрес-оцінки тягаря хвороб, що викликаються Haemophilus influenzae типу b, яка була проведена в Україні місією ВООЗ в 2003 році, показник захворюваності на Hib-обумовлений менінгіт складає від 3,7 до 17,7 на 100000 дітей у віці молодше 5 років (80-240 випадків захворювань на рік), тобто щороку не діагностується від 2 до 10% випадків цього важкого захворювання.
Бактеріологічне підтвердження клінічного діагнозу менінгококової інфекції в Україні останні роки становить від 53% до 57,4% випадків обстежених лабораторно, з коливанням в різних регіонах країни від 14,5% до 87%.
Проведення серологічного типування менінгококів є вимогою стандарту ВООЗ з епіднагляду за менінгококовою інфекцією і вкрай важливе для епідеміологічного нагляду, організації та проведення протиепідемічних заходів, короткострокового і довгострокового епідеміологічного прогнозу, а також вирішення питань застосування засобів імунопрофілактики. Результати багаторічного моніторингу показують, що в останні роки зросла роль менінгокока серогрупи В, на долю якого припадає до 47%, менінгококи серогрупи А - 16%, групи С - 16%. Проте, серологічне типування в даний час проводиться застарілими методами і значна частка збудників залишається нетипованою.
Важливим питанням є впровадження в роботу лікувально-профілактичних закладів системи моніторингу антибіотикорезистентності збудників ГБМ, особливо пневмококів.
Аналіз якості лабораторної діагностики гнійних бактеріальних менінгітів свідчить про необхідність її суттєвого поліпшення, що потребує забезпечення лабораторій сучасними імунобіологічними препаратами, в першу чергу наборами для експрес діагностики, поживними середовищами гарантованої якості для первинного посіву матеріалу, тест-штамами для дослідження антибіотикорезистентності тощо, впровадження методів молекулярно-генетичних досліджень для виявлення та типування збудників гнійних бактеріальних менінгітів.
З метою удосконалення лабораторної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів НАКАЗУЮ:
1. Затвердити "Методичні вказівки з мікробіологічної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів" (додаються).
2. Міністру охорони здоров'я АР Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних, Севастопольської міської, Головного управління охорони здоров'я та медичного забезпечення Київської міської держадміністрацій, Головним державним санітарним лікарям Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя, на водному, залізничному, повітряному транспорті:
2.1. Забезпечити своєчасну клінічну та мікробіологічну діагностику, ефективне лікування менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів у відповідності з затвердженими методичними вказівками.
2.2. Впровадити в практику роботи лікувально-профілактичних закладів систему мікробіологічного моніторингу антибіотикорезистентності збудників ГБМ, в першу чергу пневмококів.
2.3. Координацію робіт з лабораторної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів, здійснення мікробіологічного моніторингу антибіотикорезистентності покласти на бактеріологічні лабораторії епідеміологічних відділів закладів державної санітарно-епідеміологічної служби.
2.4. Забезпечити лабораторії лікувально-профілактичних закладів та установ державної санітарно-епідеміологічної служби необхідним переліком діагностичних імунобіологічних препаратів, тест-штамами для дослідження антибіотикорезистентності.
2.5. Інформацію про виконання цього наказу щороку надсилати до Центральної санітарно-епідеміологічної станції МОЗ України до 1 лютого.
3. Головному лікарю Центральної санітарно-епідеміологічної станції МОЗ України, головним державним санітарним лікарям Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя, на водному, залізничному, повітряному транспорті:
3.1. Забезпечити організаційно-методичне керівництво з лабораторної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів, узагальнення та аналіз якості досліджень, результатів мікробіологічного моніторингу антибіотикорезистентності у регіоні та підготовку спеціалістів.
3.2. Забезпечити збір штамів збудників менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів, їх підтвердження, типування, щорічний аналіз етіологічної структури та антибіотикорезистентності.
4. Вважати такими, що не застосовуються на території України:
"Методические указания по микробиологической диагностике менингококковой инфекции и бактериальных менингитов", додаток 3 до Наказу Міністерства охорони здоров'я СРСР від 1 грудня 1988 року № 858 "О мерах по усовершенствованию лечебно-диагностических и профилактических мероприятий в борьбе с менингококковой инфекцией и введению эпидемиологического надзора".
"Методические рекомендации по выделению и идентификации микробов рода Haemophilus", які затверджені начальником Головного управління карантинних інфекцій МОЗ СРСР 25.06.79 № 283-84.
5. Контроль за виконанням наказу покласти на заступника директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду (Мухарську Л.М.), начальника Управління організації медичної допомоги дітям та матерям (Моісеєнко Р.О.), директора Департаменту організації та розвитку медичної допомоги населенню (Тарана В.М.).
МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ
з мікробіологічної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів
Методичні вказівки з мікробіологічної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів встановлюють єдиний порядок відбору, транспортування клінічних зразків, та проведення лабораторних досліджень з метою діагностики та профілактики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів.
Методичні вказівки можуть бути використані в роботі усіма установами охорони здоров'я на території України незалежно від їх відомчої належності і форм власності, а також юридичними і фізичними особами, що проводять лабораторні дослідження з метою діагностики та профілактики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів.
1. Показання до лабораторного бактеріологічного обстеження
Лабораторна діагностика менінгококової інфекції (МІ) та гнійних бактеріальних менінгітів (ГБМ) здійснюється наступними методами:
- бактеріологічним - шляхом виділення, ідентифікації збудника, та вивчення його чутливості до антибіотиків;
- імунологічним - шляхом виявлення специфічних антигенів в рідинах організму (ліквор, кров та ін.) або антитіл у сироватці крові (додаток 3);
- молекулярно-генетичним - шляхом виявлення специфічних фрагментів ДНК збудника.
Матеріалом для бактеріологічного дослідження можуть бути: спинномозкова рідина (СМР), кров, ексудат із петехій, слиз із задньої стінки носоглотки, трупний матеріал.
Лабораторні обстеження проводять з діагностичною, профілактичною метою та за епідеміологічними показаннями. З діагностичною метою обстежують хворих та з підозрою на гнійні бактеріальні менінгіти, в тому числі на менінгококову інфекцію. За епідеміологічними показаннями обстежують осіб, що були в контакті з хворими на менінгококову інфекцію. З профілактичною метою обстежують групи ризику з метою визначення масивності циркуляції менінгококів та домінуючих серогруп збудника.
2. Характеристика основних збудників менінгітів
Незалежно від природи збудника клінічні прояви менінгітів відносно постійні і в діагностиці уражень та тактиці лікування особливе значення мають результати лабораторного виділення етіологічного агента. Основними збудниками гнійних бактеріальних менінгітів вважають Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae. Крім того, описані випадки захворювання на гнійні менінгіти, викликані Listeria monocytogenes, ентеробактеріями (Escherichia coli, Salmonella spp., Klebsiella pneumoniae, Citrobacter spp., Enterobacter spp., Serratia marcescens та ін.), патогенними грибками, Leptospira, Mycoplasma. У дітей раннього віку та осіб з ослабленою імунною системою гнійні менінгіти можуть бути спричинені, крім названих груп мікроорганізмів, представниками умовно-патогенної та опортуністичної мікрофлори (стафілококами, стрептококами, ацинетобактерами, псевдомонадами та ін.).
2.1. Мікроорганізми роду Neisseria
За "Визначником бактерій Берджі" (IX видання, 1994) рід Neisseria належить до "Групи грамнегативних аеробних та мікроаерофільних паличок і коків". Представники роду Neisseria є сферичними бактеріями (крім N. elongata, яка є паличкою), які формують пари; вони нерухливі, оксидазопозитивні, каталазопозитивні (крім N. elongata), деякі з них утворюють жовтий пігмент, відновлюють нітрати (крім N. gonorrhoeae та N. canis). Патогенними для людини є N. meningitidis та N. gonorrhoeae. Крім того, від людини можуть виділятись N. N. subflava, sicca, mucosa, flavescens, lactamica, cinerea, elongata, які є резидентною флорою слизових оболонок.
Neisseria meningitidis - збудник менінгококової інфекції з характерним ураженням слизової оболонки носоглотки з подальшою генералізацією у вигляді менінгококової септицемії (менінгококцемія) та запалення м'яких мозкових оболонок (менінгококовий менінгіт).
Менінгококи - грамнегативні диплококи, що складаються з двох бобовидних коків, які лежать увігнутими сторонами один до одного. Вони не мають спор, іноді утворюють ніжну капсулу. Часто розташовуються всередині лейкоцитів (але зустрічаються і поза клітиною). В мазках із культур можуть розташовуватись по одному, попарно і по чотири.
Для цих бактерій при вирощуванні на штучних середовищах характерний поліморфізм - вони змінюють розмір, форму, а при фарбуванні за Грамом можуть набувати різної інтенсивності забарвлення клітин, особливо при тривалому культивуванні. Виявлення чіткішого ставлення до забарвлення за Грамом можна досягти при використанні методики забарвлення за Грамом в модифікації Калини.
Менінгококи - аероби, ростуть при температурі (37 ± 1) град. С і рН середовища 7,2-7,6. Характеризуються високою потребою в ростових факторах, яка покривається внесенням до поживного середовища крові або сироватки ссавців. Як джерело вуглецю та азоту, менінгококи використовують амінокислоти. Для росту вони вимагають щойно приготованих середовищ. Культивування менінгококів проводять при підвищеній концентрації СО2 в атмосфері вирощування (5-10%).
Ферментативні властивості менінгококів виражені слабо; серед вуглеводів вони здатні розщепити лише глюкозу і мальтозу.
При руйнуванні бактеріальних клітин звільняється сильний ендотоксин - ліпополісахаридний комплекс, який, викликаючи каскад реакцій організма у відповідь, може призвести до розвитку інфекційно-токсичного шоку.
Менінгокок не стійкий до дії зовнішніх факторів і досить швидко гине, а при низькій температурі губить здатність до утворення колоній. Тому, при доставці матеріалу в лабораторію необхідно запобігати його охолодженню! При нагріванні до 60 град. С менінгокок гине через 10 хвилин, кип'ятіння вбиває його за 30 секунд, аналогічний ефект дає ультрафіолетове опромінення. Бактерії чутливі також до дезінфікуючих речовин: 1% розчин фенолу викликає загибель N. meningitidis протягом 1 хвилини, так само діють на них 0,5-1% розчини хлораміну, 70% етанол, 3-5% розчини карболової кислоти.
Класифікація менінгококів базується на відмінностях в структурі полісахаридів капсули; виділяють серогрупи A, B, C, X, Y, Z, Z'(29E), W135, а також H, I, K та L.
Зверніть увагу: серогрупа D в даний час не визнана.
Існують певні епідеміологічні особливості в захворюваннях, що викликаються менінгококами різних серогруп. Серогрупи A, B, C, W135 та Y найчастіше викликають менінгіт. У більшості країн менінгококова інфекція, викликана менінгококами серогрупи В, типовіша для дітей до 5 років, а випадки захворювання, викликаного менінгококами серогруп С і А, частіше спостерігаються у віковій групі від 15 до 25 років. Менінгококи серогрупи С - найчастіша причина епідемій у Африці та Азії.
Проте, перебіг менінгококової інфекції і її лікування практично не залежать від серогрупи штаму-збудника. Істотним виключенням з цього правила є захворювання, викликані менінгококами "рідких" серогруп (W135, Y, X) і може вказувати на наявність у пацієнта вродженого дефіциту термінальних компонентів комплементу, різко знижену резистентність до менінгококової інфекції і можливість повторних захворювань.
2.2. Мікроорганізми роду Haemophilus
Рід Haemophilus належить до родини Pasterellaceae, налічує 15 видів (за "Визначником бактерій Берджі" (IX видання, 1994). Представники роду являють собою дрібні (до 0,3 мкм) поліморфні нерухливі кокобактерії або палички (іноді коки, ниткоподібні бактерії), не здатні утворювати спори. За Грамом забарвлюються негативно, належать до факультативних анаеробів. Для свого росту вимагають спеціальних факторів: X (протогем або протопорфірин) та V (никотинамідаденіндинуклеотид (NAD) або NAD-фосфат).
Фактор X міститься в еритроцитах у вигляді термостабільної групи тетрапіролів, які входять до складу гематину та геміну та синтезується деякими мікроорганізмами (сарцини, стафілококи). Фактор V - термолабільний кофермент, який є складовою частиною вітамінів групи В. Обидва ці фактори присутні в крові, однак, у нативній крові барана або людини знаходяться ферменти (НАДази), здатні руйнувати V фактор. Тому V залежні гемофіли не ростуть або дають бідний ріст на кров'яному агарі.
Деякі види гемофільних бактерій патогенні для тварин і здатні викликати у них захворювання, інші - для людини. Із організму людини виділено 9 видів гемофілів, із них патогенними є H. influenzae та H. ducreyi (збудник м'якого шанкеру).
H. influenzae - типовий вид роду - каталазопозитивні, оксидазоваріабельні, редукують нітрати, розщеплюють глюкозу, мають уреазу, деякі штами виділяють індол, не утворюють сірководень. Обов'язковою умовою для росту є наявність у поживному середовищі свіжої крові (коня, барана), але самостійно H. influenzae нездатні лізувати еритроцити, тому, для вивільнення необхідних факторів росту, клітини крові руйнують при приготуванні поживного середовища (див. Методику приготування "шоколадного агару", середовища Левінталя). Антигенна структура H. influenzae включає антигени двох типів - капсульні і соматичні. За капсульним антигеном їх поділяють на 6 серотипів (a, b, c, d, e, f), які визначають при серотипуванні в РА з політиповими та монотиповими сироватками. Наявність капсули є основним фактором вірулентності. Більшість інвазивних інфекцій викликається штамами H. influenzae типу b (Hib). Капсула Hib складається із полірибозилрибітолфосфату (ПРФ), тобто містить у якості мономеру пентозу (рибозу) на відміну від інших типів, які містять гексозу, це, ймовірно, і визначає більш високий рівень їх вірулентності. Безкапсульні штами позначають як такі, що не типуються.
S. pneumoniae є представником роду Streptococcus, родини Streptococcaceae, до якого належать грампозитивні, каталазо- і оксидазонегативні бактерії сферичної форми (коки) ледь видовжені (ланцетовидні). В мазках з нативного матеріалу розташовуються парами, кожна з яких оточена товстою капсулою. Капсула утворюється в живому організмі, а тому мікроскопія мазків з нативного матеріалу має діагностичну цінність. На простих поживних середовищах капсула утворюється тоненька, але її розвиток стимулює додавання крові або сироватки до поживного середовища. У мазках з поживних середовищ можуть розташовуватись ланцюжками і бути більш округлої форми. Пневмококи нерухливі, спор не утворюють. Структура клітинної стінки пневмококів типова для грампозитивних бактерій; для них характерна наявність потужної полісахаридної капсули, яка оберігає мікроорганізм від опсонізації та фагоцитозу. Вони є факультативними анаеробами, росту яких сприяє підвищена концентрація вуглекислого газу в атмосфері інкубації до 5-7%. Добре ростуть на кров'яних або сироваткових середовищах, доповнених 0,1% глюкозою. Здатні до лізису еритроцитів, викликаючи альфа-гемоліз на кров'яному агарі (КА). Оптимум росту 37 град. С. У присутності 6,5% NaCl не ростуть, чутливі до жовчі та оптохіну. Ферментативною активністю не відзначаються: здатні розщеплювати з утворенням кислоти лактозу, рафінозу, трегалозу; можуть утворювати альфа-галактозидазу. Вид S. pneumoniae серологічно не однорідний: за антигенами капсульних полісахаридів розрізняють 84 серотипи. Для серотипування пневмококів слід використовувати комерційні тест-системи для латекс-аглютинації та коаглютинації, які виявляють капсульний антиген.
3. Взяття і доставка матеріалу для лабораторного дослідження
Відбір клінічних зразків - важливий етап в ізоляції й ідентифікації бактеріальних агентів, які спричинили менінгіт. Клінічні зразки повинні бути отримані перш, ніж почата антимікробна терапія, щоб уникнути втрати життєздатності етіологічних агентів. Відібраний для дослідження матеріал повинен бути взятий в роботу в бактеріологічній лабораторії якомога швидше.
Спинномозкова рідина (СМР). Із спинномозкового каналу, лікар за допомогою люмбальної (міжхребетної) пункції стерильно, дотримуючись правил асептики, відбирає СМР в день госпіталізації хворого. Відбирають матеріал у 3 стерильні пробірки (по 1 куб. см мінімум; при можливості, по 3-4 куб. см): пробірка № 1 для біохімічних досліджень (визначення білка та глюкози); пробірка № 2 для бактеріологічних досліджень і пробірка № 3 для цитологічних досліджень (підрахунок клітин) і доставляють в лабораторію не пізніше 2 годин після забору. Якщо негайно доставити ліквор в лабораторію неможливо, то як виключення, його слід посіяти на чашки з шоколадним і кров'яним агарами та декілька крапель внести в середовище для контролю стерильності (тіогліколеве). Помістити посіви в термостат з температурою (37 ± 1) град. С і намагаються негайно відправити до лабораторії, але не пізніше 3-х годин після забору матеріалу. Замість середовища для контролю стерильності ВООЗ рекомендує використовувати триптиказо-соєвий бульйон з 0,025% натрію поліанетолсульфонату (Laboratory Manual for the Diagnosis of Meningitis Caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. WHO/CSR/EDC/99.7/)
Під час зберігання і транспортування відібраний матеріал оберігають від охолодження і висихання. Доставка здійснюється в контейнері з грілкою або в термосі.
Слиз носоглотки. Матеріал беруть натще або не раніше 2 годин після останнього прийому їжі. Для відбору матеріалу використовують стерильний ватний тампон закріплений на дротині, загнутий під кутом 135 град. ще до стерилізації. Шпателем, тримаючи його в лівій руці, притискають корінь язика, а правою рукою вводять тампон загнутим кінцем догори під м'яке піднебіння в носоглотку і легкими горизонтальними рухами зігнутого тампона під м'яким піднебінням збирають виділення - слиз. Витягати тампон треба дуже обережно, щоб не зачепити язик, щоку і не торкнутися зубів.
Відібраний носоглотковий слиз може бути засіяний на місці його взяття на відповідні поживні середовища (див. табл. 1), матеріал втирають в середовище з усієї площі тампона з подальшим розсівом бактеріологічною петлею для отримання ізольованих колоній по усій площі чашки. Оскільки слиз носоглотки містить різноманітну мікрофлору, яка може пригнітити ріст менінгококів, то до сироваткового агару (СА) додають антибіотики, що пригнічують ріст грампозитивних мікроорганізмів (ристоміцин або лінкоміцин).
Засіяні чашки доставляють в лабораторію, ретельно захищаючи їх від охолодження та висихання.
При дослідженні за епідпоказаннями та з профілактичною метою сіють матеріал на сироватковий агар з антибіотиками.
Відібраний слиз носоглотки може бути доставлений в лабораторію і на тампоні, який занурюють в пробірку з транспортним середовищем або середовищем збагачення. Крім того, матеріал можна відбирати на змочені тампони, які потім доставляють в лабораторію. При транспортуванні слизу носоглотки на короткі відстані (1-2 години їзди до лабораторії) використання транспортних середовищ не рекомендується. При транспортуванні протягом 2-2,5 годин доцільно використання змочених тампонів. Для транспортування протягом 3 годин і більше доцільно використання транспортного середовища.
Кров. Об'єм крові необхідний для бактеріологічного дослідження залежить від віку пацієнта: у дітей раннього віку (до 2 років) відбирають 1-2 куб. см, у старших дітей (до 14 років) - 2-5 куб. см, у підлітків та дорослих - 5-10 куб. см. Стерильно з ліктьової вени беруть відповідний об'єм крові. Декілька крапель засівають на чашки СА, КА та ША, а решту матеріалу - у флакон з 0,1% напіврідким агаром або тіогліколевим середовищем у співвідношенні 1:10. Замість середовища для контролю стерильності ВООЗ рекомендує використовувати триптиказо-соєвий бульйон з 0,025% натрію поліанетолсульфонату (Laboratory Manual for the Diagnosis of Meningitis Caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. WHO/CSR/EDC/99,7/). Одночасно роблять мазок та "товсту краплю" крові для бактеріоскопічного дослідження. Чашку і флакон доставляють в лабораторію, оберігаючи від охолодження.
Ексудат із петехій. Шкіру навколо петехії обтирають 70 град. спиртом. Набирають в шприц з тонкою голкою 0,1-0,2 куб. см фізіологічного розчину, який вводять в товщу петехії і відсмоктують назад. Зачохлюють голку і передають шприц з матеріалом до лабораторії, ретельно оберігаючи його від охолодження.
Трупний матеріал (кров, ліквор, шматочки мозку, уражені ділянки мозкових оболонок, уражень шкіри і т.і.), враховуючи низьку життєздатність менінгокока, є сенс брати для дослідження тільки в перші години після смерті, поки труп ще не захолов. За даними літератури на тканинах, до яких менінгокок має тропність, збудник може зберігатись у темноті до 4-5 діб.
Кров беруть стерильно із правого серця, після розтину скальпелем, за допомогою стерильної піпетки з грушею в кількості 7-10 куб. см. Із них 2-3 куб. см засівають в 25 куб. см 0,1% напіврідкого агару або тіогліколевого середовища, на СА, КА та ША, а залишки 5-7 куб. см використовують для інших досліджень (серологічних, в реакції зустрічного імуноелектрофорезу та ін.). Для посівів можна використовувати також згустки крові із великих судин.
Ліквор беруть стерильною піпеткою із міжоболонкового простору (під час виймання головного мозку з порожнини черепа), в стерильну пробірку в кількості 3-5 куб. см і негайно висівають на чашки з поживними середовищами (ША та КА). 0,1 куб. см досліджуваного матеріалу наносять в центр чашки і розподіляють по її поверхні похитуючи. Розтирати шпателем не рекомендується.
Бактеріологічні дослідження ліквору та крові проводять за описаною схемою. Треба мати на увазі, що ріст на чашках може бути змішаним із-за попадання іншої мікрофлори, тому до загальноприйнятого набору поживних середовищ треба додати чашку сироваткового агару з антибіотиком (ристоміцин, лінкоміцин).
Матеріал з мозкових оболонок беруть стерильним ватним тампоном і засівають газоном або штрихами на чашки з "шоколадним" та сироватковим агаром та в пробірку із середовищем збагачення, роблять 2 мазки, один з яких фарбують метиленовим синім, інший - за Грамом в модифікації Калини.
Для взяття матеріалу з мозку та інших органів до місця розрізу торкаються розжареним шпателем, матеріал беруть з глибини розрізу стерильним ватним тампоном. Посів проводять звичайним способом на ті ж тверді та рідкі поживні середовища. Культури, що виросли, диференціюють за описаною схемою (Таб. 2).
Крім посівів з мозку, доцільно проводити вивчення мазків-відбитків з поверхні м'яких мозкових оболонок. Після підсушування та фіксації у суміші Нікіфорова, мазки фарбують та переглядають.
Для серологічного дослідження використовують парні сироватки крові одержані: при госпіталізації (сироватка № 1) та на 10-15 дні від початку захворювання (сироватка № 2).
Контейнери з пробами чітко маркують, скріпляють разом від кожної особи і позначають номер у відповідності з направленням (ф. 204/О), з обов'язковим зазначенням дати і часу відбору матеріалу, прізвища лікаря і номера телефону, за яким можна сповістити про попередній результат дослідження.
Первинні середовища,
необхідні для первинного посіву матеріалу від хворих на менінгіти
Матеріал | Поживні середовища | ||||||||||
КА | ША | ЖСА | Менінгоагар | МПА | Ендо | Сабуро | Тіогліколеве | Сироватковий агар | |||
Тверд. | Напіврідкий | з антибіотиками | |||||||||
Слиз носоглотковий | + | + | + | + | + | + | + | + | + | ||
Ліквор | + | + | + | + | + | + | + | + | + | ||
Кров | + | + | + | + | + | + | |||||
Секційний матеріал | + | + | + | + | + | + | |||||
Ексудат із петехій | + | + | + | + | |||||||
4. Порядок проведення досліджень
Спинномозкова рідина (СМР). Мікробіологічне дослідження ліквору складається з бактеріоскопії мазка, виділення збудника та його ідентифікації, серологічної детекції антигенів у СМР. Ліквор досліджують негайно після доставки в лабораторію. Якщо рідина мутна, посів здійснюють без попередньої підготовки. Прозору рідину центрифугують 5 хвилин при 3000 об/хв, осад висівають та мікроскопують. З матеріалу готують мазок, висушують на повітрі, фіксують сумішшю Нікіфорова протягом 5 хвилин і фарбують метиленовим синім або за Грамом в модифікації Калини. Не можна фіксувати мазки в полум'ї пальника або спиртівки!
Бактеріоскопічне дослідження проводять уважно, ретельно переглядаючи як мінімум 20 полів зору, або до того часу, поки бактерії не будуть виявлені. Пряма мікроскопія дозволяє встановити наявність бактерій, що викликали захворювання.
N. meningitidis можуть розташовуватись поза клітиною або всередині лейкоцитів, за Грамом забарвлюються негативно, виглядають як диплококи схожі на зернини кави.
H. influenzae в мазках - дрібні грамнегативні кокобактерії або палички, схильні до поліморфізму, оточені ледь помітною ніжною капсулою, розташовані у вигляді коротких ланцюжків або ниток.
Пневмококи мають вигляд ланцетовидних диплококів та коротких ланцюжків, утворюють капсулу; вони грампозитивні, добре фарбуються усіма аніліновими барвниками, при цьому капсула залишається безбарвною і помітна тільки на забарвленому фоні.
Опис морфології інших бактерій викладений у відповідних нормативних документах та довідниках.
Виявлення в мазках типових менінгококів або інших мікроорганізмів є підставою для видачі попередньої відповіді, про що негайно інформують лікаря лікувально-профілактичної установи.
Виділення збудника. Стерильною пастерівською піпеткою з дна пробірки беруть 0,3-0,5 куб. см матеріалу і по 2-3 краплі засівають: на сироватковий, 5% кров'яний, "шоколадний" (або середовище Левінталя) агари і на середовище для контролю стерильності. При необхідності, в залежності від результатів мікроскопії осаду, можна додатково зробити посів на середовища ЖСА і Ендо. Така різноманітність середовищ, що використовується для первинного посіву СМР дозволяє прискорити виділення мікроорганізмів, які можуть бути чинниками бактеріальних менінгітів. Посіви поміщають в термостат при температурі (37 ± 1) град. С і створюють умови з підвищеною концентрацією СО 2 (5-10%).
При наявності достатньої кількості СМР рекомендується 2-3 краплі засіяти на чашку з АГВ або середовищем Мюллер-Хінтона і визначити чутливість мікроорганізма до антибіотиків.
Решту СМР використовують для проведення серологічних досліджень (коаглютинація, латекс-аглютинація, імуноферментний аналіз, ЗІЕФ), полімеразної ланцюгової реакції, тощо та для посіву у середовище збагачення (4 куб. см 0,1% напіврідкого агару з 1 куб. см сироватки). Посіви СМР витримують у термостаті до 7 діб при температурі (37 ± 1) град. С з періодичними висівами на тверді поживні середовища.
Через 24 години візуально та за допомогою стереоскопічного мікроскопа переглядають усі чашки з посівами незалежно від результатів попередньої бактеріоскопії ліквору. Чашки без росту інкубують ще добу. До уваги беруть усі різновиди колоній.
Менінгокок на сироватковому агарі утворює плоскі, круглі з рівним краєм, ніжні колонії з опалесценцією розміром 2-3 мм. На "шоколадному" та кров'яному агарах його колонії ніжні, сіруватого кольору, з блискучою поверхнею та рівними краями, мають маслянисту консистенцію, розмірами до 3,0 мм. Менінгококи не змінюють кольору середовища.
Гемофіли на "шоколадному" агарі дають досить пишне розростання, їм притаманний різкий специфічний запах індолу. Колонії сірого кольору, плоскі, діаметром 0,2-2,0 мм, легко знімаються з середовища. На кров'яному агарі через добу з'являються дрібні прозорі колонії, схожі на краплинки роси або взагалі ріст може бути відсутнім. На МПА та сироватковому агарі H. influenzae не росте.
Колонії пневмококів на кров'яному, як і на "шоколадному" агарі, дрібні (діаметром 0,1-1,0 мм), сіруваті, плоскі, іноді з вдавленим центром, оточені зоною альфа-гемолізу. За зовнішнім виглядом колонії пневмококів важко відрізнити від колоній стрептококів групи В, інших "зеленячих" стрептококів - SS. mitis, oralis, sanguis, parasanguis, gordonii та ентерококів (E. faecalis), які в деяких випадках можуть викликати менінгіт, особливо у дітей до 1 року. На сироватковому агарі пневмококи утворюють дрібні, ніжні ледь жовтуваті колонії. Пневмококи при рості на кров'яному агарі можуть давати декілька типів колоній, що залежить від того, на скільки виражена капсула. Колонії пневмокока з розвинутою капсулою можуть мати декілька міліметрів в діаметрі і бути настільки слизистими, що нагадують краплину олії на поверхні агару. Їх розпізнавання не викликає труднощів. Штами, у яких не виражена капсула, дають колонії невеликих розмірів і їх виділення пов'язане з певними труднощами. При перегляді цих колоній у стереоскопічний мікроскоп можна розгледіти характерні морфологічні особливості росту цього мікроорганізма: сіруватий відтінок колоній, випукла поверхня і волога "сметаноподібна" консистенція. При тривалому інкубуванні (48 годин і більше) центральна частина колонії може опуститись, надаючи їй характерну блюдцеподібну форму (це, певною мірою, пояснюється дією аутолізинів пневмокока). Деякі штами можуть давати абсолютно сплющені колонії.
Останнім часом спостерігаються поодинокі випадки та спалахи гнійних менінгітів, які викликані піогенним стрептококом (S. pyogenes). Колонії цього збудника легко відрізнити від інших стрептококів по зоні бета-гемолізу на кров'яному агарі.
Великі (3-5 мм) колонії, які містять в собі грамнегативні палички, слід запідозрити у належності до ентеробактерій та псевдомонад.
Гриби роду Candida ростуть на всіх середовищах, не змінюючи кольору агару з кров'ю.
Мікроорганізми роду Acinetobacter добре ростуть на кров'яному і сироватковому агарах, а також на поживних середовищах без додавання нативного білка. Утворюють великі, білі, круглі й блискучі, часто слизисті колонії, на середовищах з кров'ю можуть давати зону гемолізу.
Для визначення чистоти культури та подальшого шляху ідентифікації готують мазки, фарбують за Грамом, ставлять реакцію з 3% розчином КОН та перші найпростіші біохімічні тести на оксидазу, каталазу (при підтвердженні чистоти культури), а також відсівають колонії на елективні середовища для накопичення чистої культури для подальшої ідентифікації.
Ідентифікація збудника менінгіту. Враховуючи характер росту, морфологію клітин і результати вказаних біохімічних тестів, вирішують ймовірну належність вирощеного мікроорганізму до того чи іншого роду й обирають шлях подальшого його вивчення й ідентифікації.
В таблиці 2 підсумовано мінімальну кількість ознак, достатніх для того, щоб виділені бактерії попередньо зарахувати до того або іншого таксону й обрати подальший шлях ідентифікації. На цьому етапі можлива видача попередньої відповіді.
Колонії, підозрілі на менінгокок, відсівають на СА для отримання та накопичення чистої культури, яку в подальшому ідентифікують за характерними властивостями та вивчають її чутливість до антибіотиків. Для диференціації N. meningitidis і B. (M) catarrhalis культуру відсівають у дві пробірки з СА та одну - з поживним агаром (МПА). Посіви на СА вирощують паралельно при температурі (37 ± 1) град. С та (22 ± 1) град. С, на МПА - при (37 ± 1) град. С. Одночасне культивування виділеного збудника на МПА і СА є простим і надійним тестом, що дозволяє диференціювати Neisseria meningitidis, не здатну рости на СА при (22 ± 1) град. С та на МПА при (37 ± 1) град. С, від схожої на неї B. (M) catarrhalis. Вивчають біохімічні властивості нейсерій: відсутність росту на агарі з 0,2% вмістом жовчі або затримка росту навколо дисків з жовчу; активність у відношенні до вуглеводів (глюкози, мальтози, сахарози, фруктози, лактози); редукція нітратів; здатність утворювати полісахарид на середовищі з 5% вмістом сахарози (додаток 1).
Властивості основних збудників ГБМ,
які враховуються через 24 години від початку бактеріологічного дослідження ліквору або крові
Морфологія клітин | ||||||
Поліморфні коки | Дрібні поліморфні палички** | Капсульні подовжені парні коки | Ланцюжки і пари з коків | Переважно ланцюжки з коків | Дрібні палички "частоколом" і під кутом | |
Ріст на: | ||||||
5 % КА | + | ± | + | + | + | + |
ША | + | + | + | + | + | + |
Наявність гемолізу на 5 % КА | - | - | a | a, b, g | b | b |
Зміна кольору ША навколо колонії | - | - | жовто-зелений | жовто-зелений | жовто-зелений | жовто-зелений |
Обробка колонії 3 % КОН* | + | + | - | - | - | - |
Забарвлення за Грамом | - | - | + | + | + | + |
Наявність | ||||||
оксидази | + | ± | - | - | - | - |
каталази | + | + | - | - | - | + |
уреази | - | ± | - | - | - | - |
Підозрювані мікроорганізми | N.meningi tidis | H.influen zae | S.pneumoniae | S. гр. B, viridans, E.faecalis | S.pyogenes (гр. A) | L.monocytogenes |
__________ |
|
Чиста культура, що підозрюється в належності до виду N. meningitidis, підлягає серогрупуванню за допомогою реакції аглютинації з менінгококовими сироватками.
Колонії, підозрілі на пневмокок та інші стрептококи, відсівають на КА для вивчення характеру гемолізу та чутливості до жовчі та оптохіну (Табл. 3). Крім того, за допомогою полівалентної пневмококової сироватки можна виявити пневмококові капсульні полісахаридні антигени. Для прискореного виявлення пневмокока безпосередньо із чашки первинного посіву використовують реакцію латекс-аглютинації.
Диференціальні властивості
стрептококів та ентерококів, які викликають менінгіт
Властивості | Види | ||||
S. pneumoniae | E. faecalis | S. agalactiae (гр. В) | S. pyogenes (гр. А) | "Зеленячі" * | |
Гемоліз на 5% кров'яному агарі | альфа | альфа, бета, гамма | бета | бета | альфа |
САМР - тест ** | ± | - | + | - | - |
Затримка росту навколо диску з жовчу або з оптохіном *** | + | - | - | ± | - |
Ріст на середовищі Левіна або Ендо | - | + | - | - | - |
__________ |
|
Колонії, підозрілі на H. influenzae, відсівають для вивчення потреби в X та V факторах, характерної ознаки для цього виду мікроорганізму. Для цього відібрані і вирощені на ША колонії суспендують у поживному бульйоні або пептонній воді (Дотримуйтесь максимальної обережності, не допускаючи попадання шматочків середовища до суспензії, оскільки навіть маленька часточка агару може схибити результат!). Суспензію висівають петлею великого діаметра на чашку з МПА, потім на посів викладають смужки або диски з X, V та XV факторами. H. influenzae виростає тільки навкруг дисків з XV факторами.
Основні
диференційно-діагностичні властивості роду Haemophilus
Вид | Потреба у | Каталаза | Оксидаза | бета-галактозидазна активність | Гемоліз | Утворення кислоти із | ||||
X та V факторах | СО 2 | глюкози | сахарози | лактози | манози | |||||
H. influenzae | X, V | + | + | ± | - | - | + | - | - | - |
H. influenzae біовар aegypticus | X, V | - | + | + | - | - | + | - | - | - |
H. haemolyticus | X, V | - | + | + | + | + | + | - | - | - |
H. parainfluenzae | V | - | ± | + | + | - | + | + | - | + |
H. parahaemolyticus | V | - | + | + | ± | + | + | + | - | - |
H. aphrophilus | * | + | - | - | + | - | + | + | + | + |
H. paraphrophilus | V | + | - | + | + | - | + | + | + | + |
H. sengis | V | - | ± | - | ± | - | сл + | сл + | - | - |
H. ducreyi | X | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
__________
* для первинної ізоляції потребує геміну.
Крім того, вивчити потребу в X та V факторах можна іншим шляхом.
1) Визначення здатності до сателітного росту (метод так званих "годівниць"). Для цього на чашку з КА засівають досліджувану культуру, а на поверхню зробленого посіву висівають 3-4 "бляшки" S. aureus. Якщо спостерігається ріст на КА навколо колонії гемолітичного S. aureus, досліджуваний мікроб належить до Haemophilus spp.
2) Тест з сапоніном. Досліджувану культуру інокулюють в ізотонічному розчині натрію хлориду, засівають на поверхню 5% КА. На посів кладуть диски з сапоніном та інкубують чашки 24-48 годин при температурі 37 ± 1 град. С і 5-10% СО2 в атмосфері вирощування. Наявність росту навколо диску з сапоніном і відсутність такого поза зоною гемолізу вказує на належність досліджуваного мікроорганізма до родини Haemophilus.
Для ідентифікації H. influenzae, крім потреби в X- та V-факторах, наявності каталази, оксидази, вивчають наявність бета-галактозидази, уреази, нітратредуктази та здатність до індолоутворення.
На основі тестів на продукцію індолу, уреазну і орнітиндекарбоксилазну активність розрізняють 8 біотипів (див. таблицю 5).
Біотип | Індол | Уреаза | Орнітиндекарбоксилаза |
H. influenzae I | + | + | + |
H. influenzae II | + | + | - |
H. influenzae III | - | + | - |
H. influenzae IV | - | + | + |
H. influenzae V | + | - | + |
H. influenzae VI | - | - | + |
H. influenzae VII | + | - | - |
H. influenzae VIII | - | - | - |
При підозрі на ентеробактерії, синьогнійну паличку, піогенний стрептокок, стафілокок та ацинетобактер проводять дослідження згідно з відповідними нормативними документами.
При підозрі на лістерії, якщо дозволяє кількість колоній, проводять низку досліджень, а також тест на чутливість до антибіотиків. Для L. monocytogenes, крім ознак, вказаних в табл. 2, є характерним: рухливість при кімнатній температурі, здатність розкладати мальтозу, глюкозу, не активність у відношенні до дульциту, маніту, сорбіту та арабінози. Сахарозу та гліцерин розкладає повільно. L. monocytogenes утворює крайову зону гемолізу на агарі з 5%-ним вмістом баранячої крові.
Для ідентифікації Candida albicans роблять посів з підозрілих білих випуклих колоній на середовище Сабуро та картопляну воду для визначення філаментації.
Якщо прямий посів на чашки з поживним середовищем не дав росту колоній, то слід зробити висів на чашки з КА та ША із збагачувального середовища, що інкубувалося в термостаті.
При менінгіті в СМР виявляється, як правило, один вид мікроорганізмів, мікст-інфекція мозкових оболонок зустрічається вкрай рідко. Тому, з метою прискорення видачі результату, на другий день одночасно можна робити висіви з однотипних колоній на середовище для отримання чистої культури та на диференційно-діагностичні середовища, вивчення культури за низкою ознак та на чутливість до антибіотиків.
Кров. Засіяні флакони з кров'ю поміщають в термостат при температурі (37 ± 1) град. С на 24 години.
При наявності росту у поживних середовищах первинного посіву - мікроскопують. В залежності від результатів бактеріоскопії висівають із флаконів на СА, КА чи ША. Чашки інкубують при температурі (37 ± 1) град. С в ексикаторах зі свічкою. Облік результатів посіву на СА, КА чи ША проводять так, як описано у розділі щодо дослідження ліквору.
Переглядають чашки з посівами. При відсутності росту висівають щодня або через день із флаконів з відібраним матеріалом, що інкубується, протягом тижня. При наявності підозрілих колоній відсівають їх для отримання чистої культури. Подальшу ідентифікацію гемокультури проводять як і при дослідженні СМР. Вивчають чутливість виділених мікроорганізмів до антибіотиків.
Слиз носоглотки. Доставлені засіяні чашки та тампони, занурені в напіврідке середовище, поміщають в термостат при температурі (37 ± 1) град. С.
Змочені тампони або тампони в транспортному середовищі (попередньо відтиснувши об стінки пробірки) засівають на чашку з СА, ША та КА. Засіяні чашки переносять на 24 години у термостат з температурою (37 ± 1) град. С, створивши для них умови підвищеного вмісту СО2 . На другий день переглядають чашки, засіяні напередодні, візуально та під стереоскопічним мікроскопом. При наявності росту мікроскопують підозрілі колонії і відсівають для отримання чистої культури і в подальшому ідентифікують її. При відсутності росту на чашках проводять повторний перегляд їх через 40-48 годин від посіву, і роблять висів з напіврідкого середовища збагачення.
Подальшу ідентифікацію проводять як і при дослідженні СМР. Вивчають чутливість виділених мікроорганізмів до антибіотиків.
Ексудат із петехій. Відібраний матеріал засівають на чашки Петрі з СА, що містить антибіотики (ристоміцин або лінкоміцин) для пригнічення росту мікрофлори шкіри. Із залишку ексудату готують мазки для мікроскопії. Крім того, мазки із вмісту петехій можна приготувати у вигляді відбитків. Для цього стерильною петлею обережно скарифікують поверхню петехій, потім прикладають кількома місцями стерильне предметне скло; відбитки фіксують полум'ям пальника, фарбують. На підставі даних мікроскопії можлива видача попередньої відповіді.
Засіяні чашки інкубують при температурі (37 ± 1) град. С 24 години (при відсутності росту - 48 годин), підозрілі на менінгокок колонії відсівають і вивчають за описаною схемою. Вивчають чутливість виділених мікроорганізмів до антибіотиків.
5. Методи бактеріологічного та біохімічного вивчення менінгококів, пневмококів та гемофілів
5.1. Створення підвищеної концентрації вуглекислого газу для культивування посівів Рекомендується при первинному виділенні збудників менінгіту з ліквору, крові та одержанні біомаси.
З цією метою використовують СО2 -термостати, генератори GENbox з газпакетами. При відсутності СО2 -термостатів та генераторів GENbox з газпакетами для створення підвищеної концентрації СО2 можна використовувати будь-який посуд з притертою кришкою, наприклад, ексикатор. Засіяні чашки розміщують в середині посудини догори дном, там же закріплюють запалену свічку висотою 2-3 см та накривають кришкою. До моменту затухання свічки створюється підвищена концентрація СО2 (7-10%). Після цього посіви ставлять в термостат.
Метод базується на здатності мікроорганізмів, що мають фермент каталазу, розщепляти перекис водню, утворюючи воду та кисень. Не можна використовувати для постановки тесту культуру, вирощену на кров'яному агарі, оскільки каталаза еритроцитів може давати хибно-позитивні результати.
На предметне скло наносять краплю 10% перекису водню, в неї скляною паличкою або платиновою петлею вносять культуру і розтирають круговими рухами. При позитивній реакції утворюється піна (бульбашки газу).
Для постановки тесту слід використовувати комерційні диски або смужки для визначення оксидази (такі як СІП для визначення оксидази, смужки для виявлення цитохромоксидази виробництва PLIVA-Lachema). За відсутності комерційних препаратів застосовують індофенольний метод або метод Ковача.
Дослідження проводять з тест-реактивами:
Розчин А - альфа-нафтол - 1,0 г;
Спирт етиловий (96 град.) - до 100 куб. см.
Розчин Б - N, N-диметил-п-фенілендіамін - 1,0 г;
Спирт етиловий (96 град.) - до 100 куб. см.
Інгредієнти розчинити, тест-реактиви зберігати в прохолодному темному місці розчин А - до 10 діб, розчин Б - не більше 1 дня.
Ці розчини можна безпосередньо наносити по краплі на колонію або просочити смужку фільтрувального паперу, на якому розтирають матеріал із мікробної колонії. Оксидазопозитивні культури через 0,5-1,0 хвилину дають темно-синє забарвлення.
Тетраметил-п-фенілендіаміну гідрохлорид - 0,5 г;
Дистильована вода - до 100 куб. см.
Розчинити реактив у воді, зберігати в холодильнику при температурі (6 ± 2) град. С до 2 тижнів.
Смужку фільтрувального паперу просочують реактивом, на ній розтирають матеріал із колонії. Можна нанести краплю реактиву безпосередньо на ізольовану колонію. Оксидазопозитивні культури через 10-30 сек. дають рожеве з переходом у лілове забарвлення.
Добову агарову культуру наносять у вигляді штриха платиновою чи пластиковою петлею, або скляною чи дерев'яною паличкою або пастерівською піпеткою.
Щоразу при постановці тесту проводять контрольні дослідження з тест-культурами мікроорганізмів, які дають позитивну (Pseudomonas aeruginosa) і негативну (E. coli) реакції.
5.4. Визначення сахаролітичної активності
Для визначення сахаролітичної активності використовують комерційні ідентифікаційні набори такі як: МИКРО-ЛА-ТЕСТ (Нейсеріятест, Нефермтест, Стафітест, Стрептотест, Ентеротест та ін.) фірми Pliva-Lachema; API 20 NE, API 20 E, Rapid 20 E, API Listeria, API Staph, API NH, API 20 STREP, API Candida та ін. виробництва bioMerieux (офіційний представник фірми bioMerieux в Україні СП "Бівакс"). Дослідження виконують за інструкцією до препаратів.
Можна також застосовувати індикаторні паперові тест-системи. Для цього готують 1,5 куб. см густої суспензії досліджуваної культури в ізотонічному розчині натрію хлориду з рН 7,2, вносять її по 6 крапель в 5 пробірок. В кожну з пробірок поміщають індикаторний диск з вуглеводом (глюкозою, сахарозою, лактозою, мальтозою, фруктозою або левульозою) та індикатором феноловим червоним. Пробірки заливають вазеліновим маслом і витримують в термостаті при температурі (37 ± 1) град. С. Про розщеплення вуглеводів свідчить зміна кольору дисків з малиново-червоного на жовтий. Облік результатів можливий через 6-24 години. Диски з глюкозою, лактозою і сахарозою використовують з наборів СІП для ідентифікації ентеробактерій або холерних вібріонів.
При відсутності дисків або наборів використовують середовища з вуглеводами для визначення сахаролітичних властивостей.
5.5. Визначення продукції полісахаридів N. meningitidis на агарі з 5% вмістом сахарози
Густо висівають культуру петлею на сектор чашки Петрі з сироватковим агаром, що містить 5% сахарози. Через 48 годин інкубації в термостаті при температурі (37 ± 1) град. С на поверхню вирощеної культури наносять 1 краплю водного розчину Люголя. Реакція вважається позитивною при утворенні бурого забарвлення вирощених колоній.
Реакцію на йод визначають на культурі, вирощеній бляшками на середовищі для постановки вказаного тесту (див. Додаток 2). На культуру пастерівською піпеткою наносять 1 краплю 0,25% водного розчину йоду. Позитивна реакція (поява синього забарвлення бактеріальної маси) характерна тільки для виду N.sicca.
5.7. Визначення редукції нітратів
Метод базується на здатності мікроорганізмів відновлювати солі азотної кислоти (нітрати) до солей азотистої кислоти (нітритів). Перед посівом менінгококів до нітратного бульйону додають 20% інактивованої сироватки. Посіви витримують в термостаті при (37 ± 1) град. С до 5-7 діб. Після інкубації в пробірку з культурою вносять 3 краплі реактиву Гріса (суміш розчинів № 1 і № 2) або Касаткіна.
Поява червоного забарвлення через 30 секунд після додавання реактивів Гріса або Касаткіна свідчить про редукцію нітратів до нітритів - реакція позитивна. Відсутність забарвлення свідчить про те, що реакція негативна або відбулося відновлення до послідуючих продуктів (аміаку, молекулярного азоту, оксиду азоту, гідроксиламіну). Тому при відсутності забарвлення в пробірку додають на кінчику скальпеля порошок металічного цинку і результат оцінюють знову:
- забарвлення не з'являється - нітрати в середовищі відсутні, оскільки відновлені бактеріями до нітритів і далі до послідуючих продуктів відновлення;
- з'являється червоне забарвлення - нітрати в середовищі редуковані до нітритів, але не бактеріями, а цинком (реакція негативна).
5.8. Застосування дисків з жовчу для ідентифікації збудників менінгітів
Колонії мікроорганізмів, морфологічно схожі з менінгококовими, відсівають на сектори чашок Петрі з 20% сироватковим агаром. На кожний сектор накладають стерильний диск, просочений концентрованою жовчу (диски готують заздалегідь). Культури менінгококів навколо дисків з жовчу дають зону затримки росту, що ніколи не спостерігається при рості непатогенних нейсерій.
Можна використовувати середовище з 0,2% жовчі для вивчення ставлення мікроорганізму до жовчі.
Для постановки цього тесту можна використовувати готові комерційні диски з оптохіном, які накладають на щойно посіяну на КА культуру. У пневмококів навколо диску з оптохіном утворюється зона затримки росту.
5.10. Визначення ферменту уреази
Метод базується на здатності мікроорганізмів, які мають фермент уреазу, розщеплювати сечовину до аміаку, за рахунок якого відбуваються зміни рН середовища, що визначають за зміною кольору індикатора.
Пробу на уреазу можна ставити за методом Заксе: змішують (ex tempore) реактив А (1 частину) і реактив В (19 частин). Суміш розливають у вузькі пробірки по 0,1 куб. см і вносять кілька петель досліджуваної культури. Не можна брати конденсаційну воду, оскільки вона має лужну реакцію і може змінити pH середовища, а отже і колір індикатора. Пробірки ставлять в термостат на 30 хвилин.
Уреаза розщеплює сечовину, змінює pH середовища, що призводить до його почервоніння. Якщо фермент уреаза відсутній, зміна забарвлення середовища не відбувається. Рекомендується одночасно ставити контроль середовища. Облік негативної реакції можливий тільки після 24 годин інкубації.
5.11. Визначення індолоутворення
Метод базується на здатності мікроорганізмів розщеплювати амінокислоту триптофан з утворенням індолу.
З цією метою можна використовувати папірці із СІП. Пробірки з поживним бульйоном засівають однією петлею культури і додають 2-3 краплі інактивованої сироватки коня. Пробкою затискають індикаторний папірець на індол, просочений пара-диметиламіно-бензальдегідом. Інкубують при (37 ± 1) град. С 18-24 години. При наявності індолоутворення жовтий папірець набуває рожево-малинового кольору.
Для визначення індолоутворення у H. influenzae слід використовувати "шоколадний бульйон".
5.12. Визначення наявності орнітиндекарбоксилази
У пробірку з 0,3-0,5 куб. см фізіологічного розчину вносять диск з орнітином (можна використовувати СІП) і додають декілька крапель добової бульйонної культури H. influenzae, заливають стерильним вазеліновим маслом і інкубують протягом 18-24 годин при температурі (37 ± 1) град. С. При позитивному результаті з'являється синє забарвлення.
Для визначення наявності орнітиндекарбоксилази у H. influenzae слід використовувати культуру вирощену на "шоколадному бульйоні".
5.13. Визначення наявності бета-галактозидази у штамів H.influenzae
Бета-галактозидаза - фермент, що здатний безпосередньо гідролізувати лактозу до галактози та глюкози. ONPG (O-нітрофеніл-бета-D-галактопізнозидаза) - речовина, схожа за структурою з лактозою. У присутності бета-галактозидази ONPG руйнується на галактозу і O-нітрофенол, який надає жовтого забарвлення. H. influenzae на відміну від інших представників роду не має бета-галактозидази і це використовується як диференційно-діагностична властивість мікроорганізма.
Для постановки тесту слід використовувати комерційні диски просочені ONPG.
В 0,5 куб. см фізрозчину готують густу суспензію досліджуваної культури (еквівалент 2 одиницям за стандартом мутності МакФарланда) і вносять туди диск з ONPG, інкубують при температурі (37 ± 1) град. С. Попередній облік проводять через 1 годину. Позитивна реакція - наявність жовтого забарвлення. Негативний результат може бути врахований тільки після 24 годин інкубації.
6. Методи серологічної діагностики та типування збудників гнійних бактеріальних менінгітів
Для виявлення антигенів (Аг) збудника ГБМ у якості експрес-діагностики можуть використовуватись реакція латекс-аглютинації, зустрічний імуноелектрофорез, непрямий метод флуоресцуючих антитіл, реакція непрямої гемаглютинації з антитільними еритроцитарними діагностикумами, реакція коаглютинації.
6.1. Реакція латекс-аглютинації
Відомим "некультуральним" методом виявлення антигенів збудників ГБМ є метод латекс-аглютинації (ЛА) із застосуванням відповідних комерційних тест-систем. Латексні частки, покриті специфічними антитілами до антигенів N. meningitidis, S. pneumoniae або H. influenzae, аглютинують у присутності бактеріальних антигенів, що містяться в СМР; результат аглютинації оцінюється візуально. Постановка всієї реакції займає близько 10 хв., реакція не вимагає наявності живих бактерій у СМР. Досвід роботи показує, що діагностика ГБМ методом ЛА з тест-системами фірми BioMerieux (Франція), дозволяє довести лабораторне підтвердження ГБМ до 60-70%. Однак чутливість методу ЛА порівняно невисока (біля 70%), оскільки мінімальна обумовлена концентрація бактерій у СМР методом ЛА складає від 105 до 5 х 106 бактерій/куб. см або від 1 до 50 нг антигену/куб. см. Методику постановки реакції див. в інструкції по використанню тест-системи.
В практичній діяльності найчастіше застосовуються серологічні методи типування, основані на виявленні антигенних детермінант молекул, представлених на бактеріальній поверхні, - полісахаридів, білків, липополісахарида і т.і. Як вже було сказано, менінгококи поділяються на серогрупи (за полісахаридом), серотипи і серосубтипи (за білками зовнішньої мембрани), імунотипи (за ліпополісахаридом), пневмококи - на серотипи, гемофільна паличка - на серотипи (за полісахаридом), з яких найвірулентніший серотип b.
Як правило, поверхневі макромолекули патогенних бактерій, у тому числі збудників ГБМ, є, з одного боку, факторами вірулентності, що зумовлюють можливість колонізації організму людини і генералізації інфекції, і, з іншого боку, - мішенню для специфічних і неспецифічних захисних систем людини. Тому визначення серогруп, серотипів, імунотипів бактерій дозволяє прогнозувати результат їх взаємодії із системами вродженого і набутого, у тому числі вакцинального, імунітету і є істотним елементом епідеміологічного нагляду.
Обмеження серологічних методів. Взаємодіючи із системами імунітету, поверхневі молекули піддаються найсильнішому селекційному тиску. Механізми, що приводять до фазових варіацій, мутацій, рекомбінацій, горизонтальному переносу генів забезпечують широку варіабельність поверхневих макромолекул і приводять до відсутності чіткого взаємозв'язку імунотипу штаму з його еволюційним походженням і клональною належністю: родинні штами можуть мати різні серотипи, в той час як, штами, що мають однаковий серотип, не обов'язково є еволюційно близькими.
Істотним обмеженням серологічних методів типування є необхідність виділення живої культури бактерій, що далеко не завжди можливо. Крім того, реагенти для серотипування (специфічні антитіла) в Україні не виробляються, а вартість закордонних реагентів велика, тому серотипування збудників ГБМ не проводиться. Практичні установи з метою епіднагляду проводять серогрупування менінгококів.
6.2. Реакція аглютинації на склі (див. інструкцію по застосуванню сироваток)
Реакція аглютинації в полістиролових панелях
При серологічному групуванні штамів менінгококів, особливо з носоглотки, часто спостерігається ауто- або поліаглютинація. Щоб зняти це явище, необхідно при постановці РА використовувати мікробну суспензію. Для цього рекомендуються полістиролові панелі або велике скло, на якому краплі обмежують олівцем по склу. Для кожної досліджуваної культури менінгококів використовують 1 ряд лунок панелі. Число горизонтальних лунок відповідає числу аглютинуючих групоспецифічних сироваток. Рідку сироватку кожної серогрупи у лунці розводять вдвічі (до 1 краплі сироватки додають 1 краплю суспензії культури). В окремій лунці кожного ряду готують суспензію досліджуваної культури. Необхідна густина суспензії досягається зливним ростом колоній на 1/8-1/10 частині чашки Петрі. Запаяною зігнутою пастерівською піпеткою бактеріальну масу знімають, ретельно емульгують, спочатку в 2-х краплях фізіологічного розчину, внесеного раніше в лунку. Потім для одержання оптимальної робочої густини до суспензії додають до 1,0 куб. см фізіологічного розчину. Суспензію розносять по одній краплі в горизонтальні лунки. Панелі струшують протягом 1 хвилини руками або на апараті для струшування.
Специфічну реакцію виявляють та враховують протягом 3 хвилин. Пізніший облік не виключає наявності реакції за рахунок перехресно реагуючих антигенів. Контролем служить лунка, в якій готують початкову суспензію бактерій у фізіологічному розчині.
Висновок про належність культури до тієї або іншої серогрупи роблять на основі позитивної реакції аглютинації з відповідною сироваткою по 4-хрестовій шкалі (при відсутності аглютинації в фізіологічному розчині).
При наявності реакції аглютинації з декількома сироватками тест повторюють. Для цього беруть культуру з іншого сектору зливного росту колоній, ставлять реакцію з сироватками, що взяті в розведенні 1:2; 1:4 і, в разі підтвердження попередніх результатів, досліджуваний штам визнають як поліаглютинабельний. У відповіді вказують з якими сироватками спостерігалась позитивна реакція і в яких титрах.
Якщо повторення реакції аглютинації дало інші результати, тобто культура реагувала тільки з однією сироваткою, роблять висновок про наявність клітин, що чітко групуються, і поліаглютинабельних клітин.
Визначення належності пневмококів до того чи іншого серотипу проводять за допомогою РА в пробірках з бульйонною культурою і сироваткою в розведенні 1:5 (див. "Інструкцію по використанню сироваток...")
В цій же реакції або в реакції аглютинації на склі з полі- та монотиповими сироватками визначають належність до певного серотипу H. influenzae.
{Розділ 7 виключено на підставі Наказу Міністерства охорони здоров'я № 2415 від 03.11.2021}
8. Терміни видачі відповіді та її формулювання
8.1. При бактеріологічному дослідженні ліквору та крові терміни видачі відповіді такі:
- в 1-й день на основі прямої бактеріоскопії ліквору та "товстої краплі" крові дають попередню відповідь, яка в залежності від результатів формулюється в 3 варіантах:
а) при наявності в мазках великої кількості морфологічно типових бактерій пишуть: "В спинномозковій рідині (крові) при прямій бактеріоскопії виявлені грамнегативні коки (або грампозитивні коки, грамнегативні палички), схожі по морфології з менінгококами (пневмококами, H. influenzae або іншими). Дослідження продовжується.";
б) при наявності в мазках поодиноких бактерій пишуть: "В спинномозковій рідині (крові) при прямій бактеріоскопії виявлені поодинокі (або парні) клітини коків (або паличок і т.п.). Дослідження продовжується.";
в) при відсутності будь-яких бактеріальних клітин пишуть: "В спинномозковій рідині (крові) при прямій бактеріоскопії бактерій не виявлено."
На 2-й день видають також попередню відповідь, яка, в залежності від результатів бактеріологічного дослідження, формулюється таким чином:
а) при наявності росту бактерій, типових за морфологічними та культуральними властивостями для нейсерій та інших родів пишуть: "При прямому посіві спинномозкової рідини (крові) отримано ріст нейсерій (або стрептококів, грамнегативних паличок та ін.). Вивчення культури продовжується.";
б) при відсутності росту пишуть: "При прямому висіві спинномозкової рідини (крові) росту бактерій не виявлено. Дослідження продовжується.".
На 3-й день на підставі культурально-біохімічних та серологічних властивостей бактерій, що відсіяні з чашки на другий день, видають відповідь: "Із спинномозкової рідини (крові) виділена культура менінгококів серогрупи А, В або ін. (або інша культура)". В рідкісних випадках - "M.(B.) catarrhalis".
В цей же день може бути видана попередня відповідь про ріст (або його відсутність) в результаті висіву із середовища збагачення. Формулювання таке ж, як і при оцінці результатів прямого посіву з чашки. В цей же день видають остаточну позитивну відповідь на пневмококи, яка формулюється так: "Із спинномозкової рідини (крові) виділена культура S. pneumoniae.".
На 4-й день може бути видана заключна позитивна відповідь про видову належність нейсерій, що виросли при прямому посіві, а також інших бактерій.
На цьому ж етапі, як і в наступні дні (аж до 7-8 дня), може бути видана заключна позитивна відповідь, одержана в результаті висіву із середовища збагачення. Формулювання таке ж (див. 3-й день).
Заключну негативну відповідь видають не раніше 8-го дня, коли при останньому висіві із середовища збагачення (на 7-й день його інкубації) не виявляють росту бактерій. Її формулювання: "При інкубації спинномозкової рідини (крові) на середовищі збагачення протягом 7 днів виділити бактерії не вдалося".
8.2. При бактеріологічному дослідженні відбитків-мазків з петехій хворого або шматочків тканини трупного матеріалу дають попередню відповідь, яка в залежності від результатів, формулюється в трьох варіантах (п. 8.1.).
8.3. При бактеріологічному дослідженні слизу з ротоглотки видають тільки заключні відповіді. Терміни видачі та формулювання такі: на 4-й день при виділенні культури менінгококу видають позитивну відповідь: "У носоглотковому слизі виявлені менінгококи серогрупи..." (або такі, що не піддаються серогрупуванню).
У випадках додаткового відсіву колоній з чашок, а також при використанні напіврідкого середовища збагачення термін видачі відповіді затримується на один день.
При відсутності росту менінгококів в посівах видають негативну відповідь: "У носоглотковому слизі менінгококи не виявлені".
Увага! Згідно стандартам епіднагляду рекомендованим ВООЗ лабораторним підтвердженням випадку захворювання є:
- для менінгококової інфекції -
виявлення менінгококового антигену в спинномозковій рідині, або виділення культури збудника
виділення культури або виявленням антигену Hib у СМР або в крові. Виділення штаму Hib з нестерильних локалізацій - наприклад, з носоглотки, де бактерії можуть рости, не викликаючи захворювання, не є підтвердженням Hib-інфекції.
9. Генодіагностика гнійних бактеріальних менінгітів
У зв'язку з різноманітністю збудників менінгітів і великою різноманітністю антибактеріальних препаратів, особливого значення набуває рання розшифровка етіології захворювання.
Останнім часом, поряд з бактеріологічними і серологічними методами, широко використовуються молекулярно-генетичні дослідження, а саме, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), яка дозволяє виявити в СМР і крові фрагменти нуклеїнових кислот широкого спектру збудників. Застосування методів на основі ПЛР значно покращує діагностику ГБМ, не потребуючи присутності живих мікроорганізмів у досліджуваному матеріалі; вони мають вищу чутливість порівняно з класичними методами.
Принцип ПЛР полягає в багаторазовій ампліфікації генетичного матеріалу, що міститься в досліджуваному зразку, за допомогою ферменту термостабільної ДНК-полімерази. Для генодіагностики ГБМ як зразок (матеріал для дослідження) використовуються стерильні рідини організму людини, у першу чергу, спинномозкова рідина. Розмноженню й ідентифікації піддають фрагменти генома збудників ГБМ, тобто, в першу чергу, менінгококів, пневмококів, гемофільної палички.
У порівнянні з традиційними методами діагностики, генодіагностика відрізняється високою чутливістю і дозволяє використовувати для дослідження матеріал, який не містить живі збудники, а тільки фрагменти їх генетичного матеріалу.
Результати генотипування характеризуються більшою однозначністю в порівнянні з морфологічними, біохімічними чи імунологічними методами ідентифікації мікроорганізмів і надають безпосередню інформацію для з'ясування епідеміологічних зв'язків різних збудників.
Типування збудників ГБМ вкрай важливо для епідеміологічного нагляду, проведення протиепідемічних заходів, короткострокового і довгострокового епідеміологічного прогнозу.
Методи генодіагностики і генотипування не заміняють традиційних мікробіологічних методів, але є істотним і необхідним їх доповненням. Застосування генодіагностики і генотипування дозволяє підвищити рівень діагностики менінгококової інфекції і гнійних бактеріальних менінгітів і дає можливість більш повного епідеміологічного спостереження за поширеністю різних варіантів їх збудників на території країни.
Геномна ДНК збудників ГБМ являє собою досить велику кільцеву хромосому, так, наприклад, геном N. meningitidis складається з 2,3 мільйона пар основ і близько 2160 генів. Функції багатьох генів ще невідомі, однак серед них можна виділити унікальні ділянки, специфічні для даного роду, виду, підвиду мікроорганізмів. Власне генодіагностика і полягає в розмноженні та визначенні подібності певної ділянки, що може бути зроблене за допомогою полімеразної ланцюгової реакції.
В основі методу ПЛР лежить багаторазове копіювання за допомогою ферменту ДНК-полімерази певного фрагмента ДНК. Комплементарне добудовування послідовностей може початися тільки у визначених стартових блоках - коротких двониткових ділянках. Для створення стартових блоків у заданих ділянках ДНК використовують затравки, що являють собою спеціально синтезовані in vitro олігонуклеотиди довжиною близько 20-30 основ - праймери. Праймери комплементарні послідовностям ДНК на лівій і правій межах фрагмента, що ампліфікується, і орієнтовані таким чином, що синтез ДНК, здійснюваний ДНК-полімеразою, відбувається між ними. Процес ампліфікації полягає в повторі циклів, що складаються з денатурації ДНК, відпалювання праймерів і синтезу фрагмента ДНК, який проводиться при різній температурі на приладі з програмним контролем температурного режиму - термоциклері (ампліфікаторі). У результаті відбувається збільшення кількості копій специфічного фрагмента у геометричній прогресії. Після 30-35 циклів ампліфікації синтезується 108 копій фрагмента - ампліконів, що дає змогу визначення і візуалізації їх електрофоретичної рухливості в агарозному (акриламідному) гелі. Праймери можуть бути строго видоспецифічними або родоспецифічними.
Виділення та ідентифікація збудника зі зразків СМР або крові хворого класичними бактеріологічними методами, залишаючись "золотим стандартом" діагностики, має серйозні обмеження, обумовлені застосуванням антибіотиків на догоспітальному етапі. Крім того, бактеріологічна діагностика триває не менше 2 діб.
Перевагами ПЛР є - можливість виявлення навіть декількох копій генома бактерій у зразку і, як наслідок, максимальна діагностична потужність; чутливість і специфічність, що сягають 100%, висока відтворюваність; стиснуті (декілька годин) терміни дослідження. Тому показаннями до генодіагностики ГБМ є:
- негативні результати діагностики іншими методами;
- використання для діагностики зразків СМР, узятих після антибіотикотерапії або на пізніх стадіях хвороби;
- необхідність термінового діагностичного результату;
- заміщення вартісних імунологічних методів.
Прямих протипоказів до застосування генодіагностики ГБМ не існує. Однак, з одного боку, ПЛР здатна виявити мінімальне бактеріальне забруднення досліджуваного зразка; з іншого боку, у деяких біологічних рідинах, у тому числі, СМР можлива присутність інгібіторів ПЛР. Тому при постановці реакції обов'язковим є використання позитивних і негативних контролів, висока якість усіх реагентів і їх періодична перевірка, акуратність і ретельність виконання дослідження, що дозволяє уникнути як хибно-позитивних, так і хибно-негативних результатів.
Основні вимоги до організації роботи ПЛР лабораторій викладені в ДСП 9.9.5.-080-2002. Лабораторія ПЛР-діагностики повинна бути укомплектована кваліфікованим персоналом, мати відповідні приміщення, устаткування і витратні матеріали, необхідні для виконання трьох основних етапів дослідження методом ПЛР: виділення ДНК із досліджуваного матеріалу, постановки реакції ампліфікації, обліку результатів ампліфікації. Для запобігання контамінації важливо проводити кожен етап в окремому, спеціально обладнаному приміщенні. Один і той же працівник не повинен бути задіяний на різних етапах роботи протягом одного робочого дня.
Забір і зберігання зразків біологічного матеріалу. Забір, зберігання та доставка зразків до лабораторії проводиться з дотриманням правил асептики і біологічної безпеки при роботі з інфекційним матеріалом (ДСП 9.9.5.-080-2002). Приготований з біологічних зразків чистий препарат ДНК не вважається інфекційним.
Зразки СМР забирають у хворих на ГБМ, бажано при госпіталізації в стаціонар, у рамках звичайної діагностичної спинномозкової пункції. Для запобігання хибно-позитивних результатів рекомендується використання одноразових голок для пункції і стерильних одноразових пробірок типу "Епендорф". Як правило, для ПЛР-діагностики достатньо 0,1-0,5 куб. см СМР. Використання інших асептично узятих зразків (кров, аутопсійні матеріали) можливе, але при ГБМ має менше значення.
Відібрані зразки СМР можуть бути досліджені методом ПЛР негайно, зберігатися протягом 1-3 днів при (6 ± 2) град. С, або бути піддані глибокому заморожуванню. При -20 град. С зразок може зберігатися кілька місяців, при -70 град. С практично необмежено. Варто уникати декількох циклів заморожування-розморожування зразка, тому, якщо зразок планується досліджувати неодноразово, аліквоти повинні бути розлиті в окремі пробірки.
Виділення ДНК. Зразки СМР можна використовувати в реакції ампліфікації безпосередньо; перед дослідженням проби (100 мкл СМР, покриті зверху 100 мкл мінеральної олії) інкубують в термостаті для мікропробірок 20 хвилин при 99 град. С з метою руйнування бактерій, після чого центрифугують при 10 000 g протягом 1 хвилини при кімнатній температурі і супернатант відбирають для постановки ПЛР. Концентрацію і чистоту ДНК у подібній пробі можна підвищити, додавши етап виділення шляхом сорбції. При цьому, щоб переконатися, що в кожному зразку СМР виділення ДНК пройшло успішно, у зразок СМР перед виділенням ДНК додається внутрішній контроль - препарат ДНК, наприклад, вірусу гепатиту В (HBV), а також готується додаткова пробірка без СМР, але з HBV, що являє собою негативний контроль виділення. Надалі для кожного зразка СМР ставиться реакція на виявлення ДНК HBV, що повинна дати позитивні результати.
Для виділення ДНК використовується свіжа культура бактерій, що вирощена на твердих поживних середовищах з одиночної колонії. Необхідна кількість матеріалу, як правило, одна чи кілька колоній, переноситься стерильною одноразовою петлею в стерильну одноразову пробірку з очищеною стерильною водою або фізіологічним розчином, що не містить навіть слідових кількостей бактеріальної ДНК. Безпосередньо для цілей ПЛР-діагностики препарати з виділених культур використовуються рідко, оскільки в цих випадках можлива діагностика стандартними мікробіологічними методами. Проте, чисті культури можуть бути використані для генотипування, перевірки специфічності і чутливості праймерів і тест-систем у цілому, а також у якості позитивного або негативного контролів.
ДНК із бактеріальної суспензії виділяється стандартними методами лізису/сорбції/відмивання (наприклад, з використанням наборів "ДНК-сорб", ЦНДІ епідеміології, Москва, Росія) або фенол-хлороформної екстракції. Концентрації ДНК у пробі при необхідності можна визначити спектрофотометрично при довжині хвилі 260 нм. Число мікроорганізмів, еквівалентних даній концентрації ДНК, розраховується виходячи з приблизного співвідношення: 1 бактеріальна клітина містить 4 фемтограма ДНК.
Для визначення родових ознак Neisseria, Streptococcus і Haemophilus може бути використаний ген бактеріальної 16S рибосомальної РНК. Специфічні "серогрупові" праймери розпізнають наступні гени менінгококів: для серогрупи А - унікальний ген, що кодує УДФ-N-ацетил-d-глюкозамін-2-епімеразу (mynA), для серогруп В і С - гени, що кодують полісіалілтрансферазу-D (siaD). Ці гени беруть участь у синтезі полісахаридів капсули менінгококів і праймери здатні диференціювати менінгококи серогрупи B від менінгококів серогрупи C (а також W135, Y, і інших). Теоретично праймери здатні визначити серогрупу менінгокока більше, ніж у 90% випадків захворювання, оскільки сумарно менінгококи серогруп А, В та С відповідальні більше, ніж за 90% випадків МІ в Україні. Результат ПЛР із серогруповими праймерами є додатковою перевіркою і підтвердженням вірності результатів, отриманих з родоспецифічними праймерами.
Для підвищення ефективності ампліфікації використовується методика "гарячого старту".
Аналіз і облік результатів. Продукти ампліфікації виявляються і диференціюються методом електрофорезу в 2% агарозному гелі, що містить бромистий етидій, з подальшою візуалізацією при підсвічуванні гелю ультрафіолетовим випромінюванням. Довжина ампліфікованого фрагмента гена 16S РНК Neisseria - 341 пара нуклеотидів, Haemophilus - 516 п.н., Streptococcus - 792 п.н., довжина специфічних ампліконів N. meningitidis серогрупи А - 349 п.н., групи В - 539 п.н., С - 209 п.н. Фіксацію, збереження та аналіз отриманих зображень гелів зручно проводити за допомогою спеціалізованих систем обробки зображення (Gel-Doc, БиоРад; BioTest, ЦНДІ епідеміології). При невеликому обсязі досліджень можливі і безпосередня візуальна оцінка та фотографування результатів.
Облік результатів. На доріжці (доріжках), яка відповідає позитивному контрольному зразку (зразкам), повинна бути яскрава специфічна смуга, яка світиться, на рівні довжин ампліконів, зазначених вище. Довжина амплікону визначається по додатковій доріжці, що містить маркер довжини. Позитивними вважаються зразки (клінічні проби), що містять специфічну смугу, яка світиться, більшої чи меншої інтенсивності, на тому ж рівні, що й позитивний контроль. Негативними вважаються зразки, у доріжках яких немає подібних смуг. У доріжці, що відповідає негативному контрольному зразку, не повинно бути високомолекулярних смуг (вище рівня 100 п.н.)
Результати аналізу не підлягають обліку в наступних випадках:
- Якщо в доріжці, що відповідає позитивному контролю, відсутня специфічна смуга. Причиною цього могла бути помилка в приготуванні реактивів, постановці ПЛР або збій програми ампліфікатора.
- Якщо в негативному контролі виявляється специфічна смуга, це означає, що у процесі роботи сталася контамінація реактивів або проб позитивною ДНК або продуктами її ампліфікації. У цьому випадку результати аналізу в усіх пробах вважаються недійсними. Для перевірки реактивів необхідно поставити не менше трьох негативних контролів на етапі виділення ДНК і стільки ж на етапі постановки ПЛР (без пробопідготовки) для виявлення джерела контамінації. Якщо недостовірний результат повторився хоча б один раз, необхідно замінити реактиви.
Крім того, молекулярно-генетичні дослідження можуть бути використані для вирішення не тільки діагностичних, але й багатьох епідеміологічних питань: короткострокове і локальне розслідування спалахів, глобальний довгостроковий епіданаліз. З цією метою можуть бути використані наступні способи ідентифікації амплікона: гель-електрофорез (специфічний амплікон повинен мати певну довжину і відповідну електрофоретичну рухливість); рестрикційний аналіз (амплікон піддається дії ферментів рестриктаз, які розрізають його на характерне число фрагментів певної довжини); ПЛР із імуноферментним детектуванням (аналог ІФА при якій амплікон зв'язується зі специфічним зондом) та інші.
10. Зберігання та транспортування виділених культур
Для нетривалого зберігання (до 7-10 днів) пневмокок та H.influenzae сіють на скошений ША, термостатують при (37 ± 1) град. С протягом 18-24 годин і зберігають при (6 ±- 2) град. С. Менінгокок також відсівають на скошений ША, термостатують у такому ж режимі, але зберігати його слід при кімнатній температурі.
N. meningitidis, S. pneumoniae можна зберігати протягом 5-6 тижнів методом посіву в стовпчики з оптимальним для кожного мікроорганізма поживним середовищем: для N. meningitidis - сироватковий, для S. pneumoniae - кров'яний агари. Культуру N. meningitidis засівають уколом, термостатують при температурі (37 ± 1) град. С. Через 24 години, при наявності росту культури по уколу та у вигляді бляшки на поверхні середовища, в пробірку наливають 1,5-2 куб. см стерильного вазелінового масла і в такому стані зберігають, транспортують, не допускаючи охолодження. Засіяний матеріал із однієї пробірки можна використовувати декілька разів для пересівів.
Зберігання культур менінгокока в лабораторних умовах можна здійснювати таким способом. Культуру засівають на чашку з агаром, що містить 20% нормальної кінської сироватки, ставлять для підрощування на 3-4 години в термостат при температурі (37 ± 1 град. С), після чого ставлять в холодильник (6 ± 2) град. С на 1-7 днів. Відновлення культивування штамів здійснюється шляхом перенесення цих же посівів знову в термостат при температурі (37 ± 1) град. С на 18-20 годин. Такий спосіб зберігання виключає багаторазовий пересів культур, не потребує підвищеного вмісту СО2 в атмосфері, дозволяє зберігати культури, первинний посів яких утворюється з однієї або декількох колоній, а також зберегти капсулу та стабільність аглютинаційних властивостей.
Для зберігання культури пневмокока, її переносять повною петлею на скошений кров'яний агар, і витримують, без попередньої інкубації протягом 4-6 днів при температурі (4-22) град. С. Для одержання свіжої культури з поверхні засіяного агару роблять пересів на свіже середовище такого ж складу, після чого ставлять в термостат на добу при температурі (37 ± 1) град. С.
H. influenzae також швидко відмирає. Життєздатність гемофілів можна продовжити до 1 місяця, для чого слід зробити густий посів на скошений "шоколадний" агар і після добової інкубації створити повну герметизацію. Таку культуру для пересіву використовують тільки одноразово.
Для тривалого зберігання штамів основних збудників менінгітів можна використовувати ліофілізацію культур або їх заморожування. Для останнього необхідно виростити мікроорганізм на відповідному середовищі (H. influenzae - на ША, а S. pneumoniae та N. meningitidis - на КА або ША) протягом 18-24 годин при температурі (37 ± 1) град. С у ємкості з підвищеним вмістом СО2. Переконатись у чистоті культури, зібрати вирощену культуру у кріофлакон з 1 куб. см гліцеринового бульйону, промаркувати і заморозити при -20 град. С або -70 град. С. При цьому слід пам'ятати, що не можна допускати розморожування та повторного заморожування бульйону з культурою, оскільки штам загине. Якщо бульйон розтане, слід рекультивувати і заморозити вирощену культуру знову.
11. Організаційно-методична робота бактеріологічних лабораторій
Бактеріологічні лабораторії Кримської республіканської СЕС, обласних, Київської та Севастопольської міських, Центральних на водному транспорті виконують такі функції:
11.1. Надання консультативної та практичної допомоги підвідомчим лабораторіям СЕС та ЛПЗ.
11.2. Підготовка спеціалістів з лабораторної діагностики гнійних бактеріальних менінгітів.
11.3. Вивчення обсягів досліджень на гнійні бактеріальні менінгіти підлеглих контингентів, оцінка їх достатності спільно з епідеміологами та інфекціоністами, аналіз показників якості діагностики.
11.4. Визначення потреби в поживних середовищах та діагностичних препаратах, організація постачання підвідомчих лабораторій.
11.5. Контроль якості бактеріологічної діагностики гнійних бактеріальних менінгітів та впровадження заходів щодо покращання цієї роботи на території, що обслуговується:
- аналіз показників роботи лабораторій;
- контроль за якістю ідентифікації культур збудників гнійних бактеріальних менінгітів;
- проведення паралельних досліджень.
11.6. Вибірковий контроль якості поживних середовищ, що готуються у лабораторіях.
11.7. Відправка виділених атипових та таких, що виділені вперше або рідко зустрічаються штамів збудників гнійних менінгітів до бактеріологічної лабораторії ЦСЕС МОЗ України для подальшого їх вивчення.
12. Обов'язки спеціалістів лабораторій, що проводять дослідження з метою діагностики гнійних бактеріальних менінгітів
12.1. Навчити медичний персонал правилам взяття, посіву та доставки матеріалу до лабораторії.
12.2. Систематично контролювати правильність взяття і доставки матеріалу.
12.3. При прийомі матеріалу переконатися у тому, що він відібраний та доставлений до лабораторії без порушень. Перевірити відповідність маркування на пробірці із записом в направленні.
12.4. У реєстраційному журналі треба вказати дату, час і правильність надходження матеріалу (порушення вказувати конкретно). Матеріал приймається і досліджується незалежно від встановленого порушення. Про порушення та необхідність повторного взяття матеріалу інформується відповідальна особа закладу, звідки надійшов матеріал. Якщо на протязі 3 годин матеріал повторно не надійшов до лабораторії, ситуація розцінюється як надзвичайна, про що сповіщається керівництву ЛПЗ (СЕС).
12.5. При виникненні в процесі діагностичного дослідження підозри на наявність в матеріалі менінгококів, гемофілів, пневмококів або інших бактерій, негайно інформуються відповідні спеціалісти СЕС і ЛПЗ. У реєстраційному журналі фіксується коли (дата, час) і кому (прізвище, посада) подано повідомлення. Оперативна інформація по телефону повинна супроводжуватися письмовою випискою на офіційному бланку.
12.6. Кожне приготування поживних середовищ повинно реєструватися у "Журналі приготування і контролю якості поживних середовищ" ф. 256/0 і контролюватися.
12.7. Кожен лікар повинен систематично аналізувати якість діагностики та вживати необхідні заходи щодо її поліпшення.
12.8. Порядок знищення отриманих культур, збудників ГБМ визначається закладом вищого рівня управління.
12.9. Усі штами N. meningitidis негайно повинні бути направлені до закладу вищого рівня управління (базову лабораторію) для серологічного типування. Усі сумнівні, атипові штами (мазки первинної бактеріоскопії) терміново мають бути направлені до закладу вищого рівня управління (базову лабораторію) для подальшого вивчення або слід повідомити про необхідність одержання консультації.
12.10. Персонал лабораторії повинен суворо дотримуватись правил протиепідемічного режиму роботи згідно ДСП 9.9.5.-080-2002.
13. Штами для контролю якості поживних середовищ та постановки тестів ідентифікації
Усі середовища обов'язково перевіряються перед використанням на стерильність (відсутність росту на них після інкубування протягом 48 годин при температурі (37 ± 1) град. С. Крім того, вони повинні забезпечувати типовий ріст контрольних штамів. (Табл. 6).
Середовище (реагент) | Контрольний штам мікроорганізма | Особлива назва | Очікуваний результат |
1 | 2 | 3 | 4 |
Забарвлення за Грамом в модифікації Каліни | Staphylococcus aureus | ATCC 25923 | Зеленувато-чорні коки |
Escherichia coli | ATCC 25922 | Яскраво рожеві палички | |
Кров'яний агар | Staphylococcus aureus | ATCC 25923 | Ріст типових колоній |
Escherichia coli | ATCC 25922 | Ріст типових колоній | |
Шоколадний агар | Haemophilus influenzae | NCTC 11931 | Ріст типових колоній |
Сироватковий агар | C. pseudodiphtheriticum | Ріст типових колоній | |
Менінгоагар | N. meningitidis | A 208 B 0657 C 23252 | Ріст типових колоній |
Мюллер-Хінтон агар та АГВ | Escherichia coli | ATCC 25922 | Відповідні зони затримки росту тест-штамів |
Staphylococcus aureus | ATCC 25923 | ||
Pseudomonas aeruginosa | ATCC 27853 | ||
Оксидаза | Pseudomonas aeruginosa | ATCC 27853 | Позитивний контроль (рожеве забарвлення за методом Ковача або синьо-фіолетове за індофенольним) |
Escherichia coli | ATCC 25922 | Негативний контроль (зміни кольору не відбувається) | |
Каталаза | Escherichia coli | ATCC 25922 | Позитивний контроль |
Streptococcus spp. | Негативний контроль | ||
Нітратредуктаза | Escherichia coli | ATCC 25922 | Позитивний контроль |
M. luteum | Негативний контроль | ||
Лактоза | E. coli O55 | Позитивний контроль (червоний колір середовища змінюється на жовтий) | |
S. flexneri 1a | Негативний контроль (червоний колір середовища не змінюється) | ||
Сахароза | K. pneumoniae | Позитивний контроль (червоний колір середовища змінюється на жовтий) | |
S. flexneri 1a | Негативний контроль (червоний колір середовища не змінюється) | ||
Глюкоза | S. flexneri 1a | Позитивний контроль (червоний колір середовища змінюється на жовтий) | |
Pseudomonas aeruginosa | Негативний контроль (червоний колір середовища не змінюється) | ||
Мальтоза | K. pneumoniae | Позитивний контроль (червоний колір середовища змінюється на жовтий) | |
P. mirabilis | Негативний контроль (червоний колір середовища не змінюється) | ||
Уреаза | C. pseudodiphtheriticum | Позитивний контроль | |
C. diphtheriae | Негативний контроль | ||
Оптохін | S. pneumoniae | Чутливий до оптохіну, ріст відсутній | |
Потреба X і V факторів | Haemophilus influenzae | NCTC 11931 | Ріст при наявності і X, і V факторів |
бетагалактозидаза | Escherichia coli | ATCC 25922 | Позитивний контроль (змінює забарвлення на жовте) |
P. mirabilis | Негативний контроль |
Зони
інгібіції тест-штамів на середовищі Мюллер-Хінтон
Тест-диски | Зони інгібіції тест-штамів, мм | ||
Escherichia coli ATCC 25922 | Staphylococcus aureus ATCC 25923 | Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 | |
Карбеніцилін 100 мкг | 23-29 | - | 18-24 |
Гентаміцин 10 мкг | 19-26 | 19-27 | 16-21 |
Тетрациклін 30 мкг | 18-25 | 19-28 | - |
Поліміксин В 300 Од | 12-16 | 7-13 | - |
Ампіцилін 10 мкг | 16-22 | 24-35 | - |
Сульфаметоксазол 1,25 мкг + + Триметаприм 23,75 мкг | 24-32 | 24-32 | - |
Мікробіологічні дослідження з метою діагностики та профілактики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів проводять з дотриманням вимог біологічної безпеки відповідно до ДСП 9.9.5.-080-2002 "Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю".
КУЛЬТУРАЛЬНІ ТА БІОХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ
нейсерій і M.(B.) catarrhalis
ПРИГОТУВАННЯ
поживних середовищ та індикаторів
Загальні вимоги до виготовлення поживних середовищ викладені в ГОСТ 10444.1-84.
З метою підвищення достовірності та якості досліджень перевагу слід віддавати поживним середовищам та діагностичним препаратам промислового виробництва.
У випадку відсутності готових комерційних поживних середовищ, середовища готуються за пропонованою рецептурою.
Згідно сучасних вимог для приготування поживних середовищ замість дистильованої води використовують воду очищену.
Дату приготування та результати контролю якості поживних середовищ реєструють в "Журналі приготування та контролю поживних середовищ" (ф. № 256/0).
За основу використовують комерційний МПА, рН - 7,4, амінний азот 150-180 мг/куб. см. Як основу можна використовувати середовище АГВ. До 80 куб. см розплавленої та охолодженої до температури 50 град. С агарової основи додають 20 куб. см інактивованої при температурі 56 град. С протягом 30 хвилин сироватки, консервованої хлороформом або без консерванту (при інактивації сироватки консервант зникає). Після перемішування середовище розливають в чашки. Середовище придатне до вживання протягом 48 годин при зберіганні його в холодильнику. Перед посівом чашки, що зберігалися в холодильнику, підігріваються до температури (37 ± 1) град. С.
Для поліпшення росту менінгокока можна разом з сироваткою додавати 2 куб. см 40% розчину стерильної глюкози. В цьому випадку для приготування агарової основи треба збільшити наважку для 100 куб. см дистильованої води на 0,5 г сухого середовища (МПА або АГВ).
1.1. Сироватковий агар з ристоміцином
До 80 куб. см розплавленого та охолодженого агарового середовища додають 20 куб. см сироватки та 0,1 куб. см розчину ристоміцину, що містить 20000 МО/куб. см (залишкова концентрація антибіотика 20 МО/куб. см поживного середовища). Препарат розводять стерильним фізіологічним розчином до робочої концентрації, розливають у стерильні пеніцилінові флакони або центрифужні пробірки під ватними або гумовими пробками та заморожують в морозильній камері до використання. Кількість робочого розчину у флаконах або пробірках залежить від потреби лабораторії.
В разі необхідності розчин розморожують та додають до середовища. Наприклад, у флакон, що містить 100000 МО ристоміцину, вносять 5 куб. см стерильного фізіологічного розчину. Одержане розведення препарату є робочим. Його зручно розлити по 0,5 куб. см та заморозити. В такому стані препарат може зберігатися декілька місяців.
1.2. Сироватковий агар з лінкоміцином
До 80 куб. см розплавленого та охолодженого агару додають 20 куб. см сироватки та 0,5 куб. см розчину лінкоміцину в концентрації 1000 мкг/куб. см. Залишкова концентрація антибіотика в середовищі - 5 мкг/куб. см поживного середовища. Розчин лінкоміцину зберігають при температурі (6 ± 2) град. С протягом 6 місяців.
Кров'яний агар готують на тих же поживних основах, що і сироватковий агар. До розплавленого та охолодженого до температури 50 град. С агару додають 5% дефібринованої крові (барана, кроля або коня), ретельно змішують, уникаючи утворення піни та пузирів, і розливають в чашки Петрі.
Кров людини для приготування середовища використовувати не бажано!
3. "Шоколадний" агар (кип'ячений)
Для приготування може бути використана кров барана, кролика або коня. Кров інших тварин може містити Н-антифактор, який необхідно інактивувати шляхом кип'ятіння. Кров людини для приготування середовища не придатна!
Це середовище можна готувати декількома способами:
1) Поживний агар з рН 7,3-7,4 розплавляють, охолоджують до температури 50 град. С. Стерильно додають 10-15% нативної або дефібринованої крові. Ретельно перемішують і ставлять на водяну баню при температурі 100 град. С на 5 хвилин. Вдруге перемішують і ставлять на водяну баню при температурі 100 град. С на 2-3 хвилини. Знову ретельно перемішують і залишають у водяній бані при 70-80 град. С на одну годину. Після цього охолоджують до 45-50 град. С, додають 5% дріжджового екстракту або стимулятор росту типу "Полівітекс", "Ізовіталекс", ретельно розмішують і розливають в чашки Петрі.
2) Поживний агар з рН 7,3-7,4 розплавляють, охолоджують до температури 50 град. С. Стерильно додають 5% нативної або дефібринованої крові. Ретельно перемішують і ставлять на водяну баню при температурі 100 град. С на 3 хвилини. Вдруге додають 5% крові, перемішують і ставлять на водяну баню при температурі 100 град. С на 3 хвилини. Після цього охолоджують до 45-50 град. С, додають 5% дріжджового екстракту або стимулятор росту типу "Полівітекс", "Ізовіталекс", ретельно розмішують і розливають в чашки Петрі.
Приготування середовища аналогічне такому для шоколадного агару, але основою його служить поживний бульйон.
За прописом на етикетці готують поживний бульйон. До нього додають 10% крові і 5% дріжджового екстракту. Прогрівають так як і в попередньому рецепті.
До розплавленої та охолодженої до 70 град. С агарової основи, виготовленої на комерційному МПА, додають 10% дефібринованої крові. Ретельно перемішують і ставлять на вогонь увесь час струшуючи. При появі піни агар знімають з вогню. Повторюють таке кип'ятіння 3 рази. Відстоюють, прозору частину розливають стерильно у чашки Петрі або флакони.
Інший спосіб приготування цього середовища запропонував А.В. Шапіро. Після внесення крові середовище фільтрують через 4 шари марлі у сушильній шафі при 80 град. С протягом 30 хв. та розливають у чашки Петрі (пробірки).
При відсутності дисків з жовчу можна користуватись жовчно-сироватковим агаром.
5,0 г сухої бичачої жовчі розчиняють в 100 куб. см дистильованої води, фільтрують через ватно-марлевий фільтр, доводять рН до 7,2-7,4, стерилізують при (112 ± 2) град. С - 30 хв. До 80 куб. см розплавленого та охолодженого до температури 50 град. С поживного агару додають 4 куб. см стерильного розчину жовчі, перемішують, додають 20 куб. см сироватки тварин, знову добре перемішують і розливають у чашки Петрі. Залишкова концентрація жовчі в середовищі - 0,2%. Посів культур нейсерій проводять штрихами на сектори чашки.
5. Середовища з вуглеводами для визначення сахаролітичних властивостей нейсерій
До 75 куб. см агарової основи, якою може служити МПА, додають 0,9 г одного з вуглеводів (глюкоза, мальтоза, сахароза, левульоза або D-фруктоза) і 3,9 куб. см розчину індикатора фенолового червоного. Агар стерилізують при (112 ± 2) град. С - 30 хв. однократно. Перед вживанням середовище, що містить вуглеводи, розтоплюють на водяній бані, охолоджують до температури 48-50 град. С, додають 20% сироватки крові великої рогатої худоби і розливають у чашки. На одну чашку можна висіяти 6-8 культур (секторами). Таким чином, кожна культура засівається на 4 чашки з різноманітними вуглеводами. Можна приготовані середовища розлити у пробірки по 6 куб. см і скосити їх. Посів робити на скошену поверхню.
Облік результатів проводять через 24 години інкубації в термостаті. При розкладанні вуглеводу з утворенням кислоти, червоний колір середовища в секторі цієї культури змінюється на яскраво жовтий. Із вказаних вуглеводів менінгокок розщеплює з утворенням кислоти глюкозу та мальтозу. При відсутності розщеплення зберігається вихідний червоний колір середовища.
6. Середовище для визначення продукції полісахаридів на агарі з 5% сахарози
До розплавленого і охолодженого до 50 град. С поживного агару з 5% сахарози додають 20% сироватки і розливають в чашки Петрі.
7. Середовище для тесту відновлення нітратів в нітрити
До 100 куб. см поживного бульйону pH 7,3-7,5, вільному від нітритів (перевірити реактивом Грісса або Касаткіна), додають 0,1% вільної від нітритів калійної селітри (0,1 г KNO3 ), перевіривши ще раз на вміст нітритів, розливають по 5 куб. см в промиті дистильованою водою не менше як 5 разів пробірки. Стерилізують 15 хвилин при (121 ± 1) град. С.
8. НТМ агар (Середовище для тестування гемофілів)
НТМ агар краще використовувати комерційний, оскільки його приготування трудоємке.
До розчиненої наважки (вказаної на етикетці) агару Мюллер-Хінтона додають дріжджовий екстракт до кінцевої концентрації 5 мг/куб. см і розчину гематину до кінцевої концентрації 15 мг/куб. дм.
Для приготування основного розчину гематину до 50 г порошку додають 100 куб. см 0,01N NaOH (0,01 моль/куб. дм) і нагрівають при ретельному перемішуванні до повного розчинення.
В підготовлене до автоклавування середовище на 1 куб. дм вносять 30 куб. см основного розчину гематину.
Після автоклавування і охолодження основи на водяній бані до температури 45-50 град. С в неї асептично вносять 3 куб. см матричного розчину НАД (нікотинамідаденіндинуклеотид) на 1 куб. дм агару до кінцевої концентрації 15 мг/куб. дм.
Для приготування матричного розчину 50 мг НАД розчиняють в 10 куб. см дистильованої води і стерилізують фільтрацією через мембранні фільтри з розміром пор 0,45 мкм.
При тестуванні триметоприму або ко-тримоксазолу слід додатково асептично внести 0,2 МО/куб. см тімідинфосфорилази.
Приготований агар розливають в стерильні чашки. На чашку діаметром 100 мм необхідно 25 куб. см агару, діаметром 90 мм-20 куб. см для того, щоб товщина агару у чашці була 4 ± 0,5 мм.
Агар застигає при кімнатній температурі. Чашки з застиглим агаром необхідно підсушити з прокритими кришками в термостаті при температурі 35 град. С протягом 10-30 хвилин для видалення надлишку конденсату.
9. Реактиви для визначення ферменту уреази за методом Заксе
РЕАКТИВ A: | РЕАКТИВ B: |
Сечовина - 2 г. | 0,2 % розчин фенолрот - 1 куб. см, |
96° етиловий спирт - 2 куб. см. | Однозаміщений фосфат калію (KH2PO4) - 0,1 г. |
Дистильована вода - 4 куб. см. | Двозаміщений фосфат калію (K2HPO4) - 0,1 г. |
Хлористий натрій (NaCl) - 0,5 г. | |
Дистильована вода - 100 куб. см. |
Реактив А не стерилізують і зберігають при температурі від (6 ± 2) град. С. Реактив В стерилізують в автоклаві текучою парою.
Розчин № 1 - 0,8% сульфанілової кислоти в 5 № оцтовій кислоті.
Розчин № 2 - 0,6% диметилальфанафтаміну в 5 № оцтовій кислоті. Перед проведенням реакції змішують рівні об'єми розчинів № 1 і № 2.
Зберігати розчини слід в темному посуді з притертими кришками.
Пам'ятати! Реактив придатний для користування протягом 15 хв., безколірний, при появі рожевого забарвлення не використовувати.
Розчин № 1 - 0,1%-ний розчин риванолу в дистильованій воді.
Розчин № 2 - 12%-ний розчин соляної кислоти (HCl).
Перед виконанням реакції змішують рівні об'єми розчинів № 1 та № 2. Реактивна суміш придатна для використання протягом 15 хвилин.
12. Індикатор феноловий червоний (фенолрот)
0,4 г порошку фенолрот змішують з 16 куб. см 0,1N NaOH і витримують в термостаті до повного розчинення при частому струшуванні. Розчин доводять до об'єму 200 куб. см дистильованою водою, розливають у флакони і стерилізують при (121 ± 2) град. С 20 хв.
Для приготування розчину Люголя беруть калія йодистого - 2 г, дистильованої води - 10 куб. см, йоду кристалічного - 1 г. Суміш ретельно укупорюють, залишають на добу, потім додають 300 куб. см дистильованої води.
14. Транспортні середовища для виділення менінгококів з носоглоткового слизу
Як середовища збагачення можна використовувати вірусологічні середовища Ігла або 199.
14.1. Бульйон для приготування змочених тампонів
Бульйон готують на будь-якій поживній основі з доданням 20% сироватки тварин та ристоміцину з розрахунку 20 МО/куб. см середовища. Використовують ватні тампони на алюмінієвих стержнях, вмонтовані в пробірку. Перед виїздом тампони стерильно змочують бульйоном (10-12 тампонів в 5 куб. см бульйону).
14.2. Рідке транспортне середовище з лінкоміцином
Використовують будь-який поживний бульйон або 2% пептонну воду, рН 7,2-7,6. До 100 куб. см стерильного бульйону додають 0,5 куб. см лінкоміцину в концентрації 1000 мкг/куб. см. Залишкова концентрація лінкоміцину 5 мкг/куб. см. Середовище зберігається при температурі (6 ± 2) град. С не більше 2 діб. Безпосередньо перед взяттям ротоглоткового слизу (можна в приміщенні, де знаходяться обстежувані особи) середовище розливається по 1 куб. см в стерильні пробірки. Перед зануренням тампону, пробку виймають, тампон вставляють у пробірку так, щоб матеріал був занурений в середовище; пробірку з вставленим тампоном знову закривають. Транспортують у вертикальному положенні при температурі не нижче +22 град. В лабораторії тампони відтискають об стінки пробірок, проводять посіви на сироватковий агар без антибіотиків в чашки Петрі. На одній чашці можна помістити 2 посіви.
14.3. Напіврідке середовище збагачення
До 80 куб. см напіврідкого поживного агару додають 20 куб. см сироватки та 0,1 куб. см розчину ристоміцину, що містить 20 000 МО/куб. см (залишкова концентрація 20 МО/куб. см поживного середовища). Розливають у пробірки по 3 куб. см, витримують 2 доби в термостаті для контролю, зберігають температурі (6 ± 2) град. С.
Стандартні паперові диски для антибіотиків, або квадрати фільтрувального паперу розміром 5 х 5 мм стерилізують, просочують стерильною жовчу великої рогатої худоби і після сушки в сушильній шафі при температурі 60 град. С (можна в термостаті або при кімнатній температурі протягом доби) поміщають у стерильну пробірку. Зберігають при температурі (6 ± 2) град. С 1 рік.
Стандартні паперові диски, попередньо простерилізовані, просочують оптохіном (етилгідрокупреїн гідрохлорид) в концентрації 1:1000-1:5000 (доза підбирається емпірично), висушують, як і диски з жовчу. Зберігають при температурі (6 ± 2) град. С 1 рік.
17. Диски з мальтозою та фруктозою
До 2 куб. см пептонної води, рН 7,2 додають 1 г вуглеводу і 0,5 куб. см 1% водного розчину фенолового червоного. Суміш нагрівають на водяній бані до повного розчинення вуглеводу. Розчином просочують диски або квадрати фільтрувального паперу (10 x 10 мм). Підсушують. Зберігають при температурі (6± 2) град. С 1 рік.
18. Тампони для забору носоглоткового слизу
Для забору носоглоткового слизу використовують ватні тампони, на металевому, краще алюмінієвому дроті діаметром 2-3 мм. Дротики згинають під кутом 135 град. на відстані 3-4 см від кінця, на який накручений ватний тампон. Тампони вставляють у пробірки і стерилізують в автоклаві.
ЗАСТОСУВАННЯ РЕАКЦІЇ
непрямої гемаглютинації для виявлення протименінгококових антитіл
1. Показання до проведення серологічних досліджень
Реакцію непрямої гемаглютинації (РНГА) з менінгококовими еритроцитарними діагностикумами серогруп А, В, С використовують у таких випадках:
а) як додатковий метод діагностики менінгококової інфекції. Обов'язковою вимогою є дослідження сироваток крові хворих, які взято у різні терміни від початку захворювання, тобто у динаміці. Оптимальним варіантом є обстеження усіх осіб (скринінг) з підозрою на генералізовані форми менінгококової інфекції (ГФМІ), що дозволить істотно збільшити відсоток лабораторного підтвердження ГФМІ (у дорослих - до 80%, у дітей до 60% випадків);
б) для ретроспективного виявлення локалізованих форм менінгококової інфекції в осередках захворювання;
в) при здійсненні імуно-епідеміологічних досліджень серед населення з метою визначення серонегативних контингентів;
г) при оцінці імунологічної ефективності протименінгококової вакцинації.
2. Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА) з еритроцитарними менінгококовими діагностикумами
РНГА ставлять як макро- так і мікро-методом; в останньому випадку використовують мікротитратори "Такачі" або багатоканальні дозатори. Відмінності між цими методами полягають лише в об'ємах використовуваних інгредієнтів та термінах обліку результатів реакції. При макрометоді реагуюча суміш у кожній лунці складається із 0,5 куб. см відповідного розведення сироватки крові та 0,25 куб. см діагностикуму. При мікрометоді об'єми зменшуються: 0,05 куб. см та 0,025 куб. см відповідно.
Облік результатів дослідження у мікрометоді здійснюють через 2 години інкубації у термостаті, при макрометоді інколи необхідна додаткова експозиція протягом 1-2 години при кімнатній температурі.
Постановка здійснюється згідно інструкції до застосування діагностикумів.
Для серологічних досліджень кров від хворого на МІ або підозрілого на цю інфекцію забирають із ліктьової вени з додержанням звичайних правил асептики, при масових серологічних дослідженнях кров беруть із пальця.
Після утворення згустку одержану сироватку відсмоктують стерильною піпеткою у стерильний посуд (пробірки, ампули).
Зберігають у холодильнику при (6 ± 2) град. С. У реакції досліджують сироватки без ознак проростання.
Перед постановою РНГА сироватки розводять у співвідношенні 1:5 вихідним буфером (ЗФР). Титрування сироваток крові здійснюють у стабілізуючому буфері.
Робота з сироваткою проводиться з дотриманням вимог біологічної безпеки.
4. Рекомендовані терміни, кратність обстеження та трактування результатів серологічних досліджень
При виборі оптимальних термінів та кратності обстеження хворих на ГФМІ і для правильного трактування результатів серологічних досліджень потрібно взяти до уваги ряд факторів, що впливають на рівень антитіл: вік хворого, преморбідний фон, клінічна форма, тяжкість і період хвороби, супутні захворювання, серологічні особливості збудника. При менінгококовій інфекції, як і при інших інфекційних захворюваннях, правильна оцінка серологічних досліджень можлива тільки при їх співставленні з епідеміологічними та клінічними даними.
Оптимальні терміни взяття крові у хворих - перші дні хвороби (1-3 дні), другий, третій та наступні тижні хвороби. Першу сироватку крові потрібно брати відразу при госпіталізації хворого, наступні - через 7-10 днів.
4.1. РНГА при генералізованих формах менінгококової інфекції
4.1.1. РНГА з діагностикумами А і С
Антитіла із групоспецифічними полісахаридами менінгококів серогруп А та С при ГФМІ можна виявити вже в перші дні хвороби. Кількість серопозитивних осіб серед дорослих хворих складає в указані строки біля 40%. Максимальний рівень антитіл відзначається на другому-третьому тижні хвороби, з четвертого-п'ятого тижня рівень антитіл поступово знижується.
За умовно-діагностичний титр антитіл до полісахаридів менінгококу серогруп А і С у дорослих і дітей старших за 3 роки приймають позитивну реакцію в розведеннях 1:40-1:80, у неінфікованих в момент обстеження антитіла у таких титрах зустрічаються порівняно рідко (9-11%).
У дітей віком до 1 року вироблення антитіл виражено слабо, у зв'язку з чим позитивні реакції спостерігаються звичайно у більш пізні терміни (з другого тижня хвороби).
У дітей, молодших за 3 роки, за умовно-діагностичний титр антитіл до полісахаридів А і С приймають позитивну реакцію у розведенні 1:20 та вище, оскільки в здорових дітей цього віку антитіла не виявляються або зустрічаються у поодиноких випадках у титрах не вище, ніж 1:5-1:10.
Інтенсивність антитілоутворення не однакова при різних клінічних формах менінгококової інфекції. При менінгококцемії і змішаних формах (менінгококцемія + менінгіт) рівень антитіл звичайно вищий, ніж при інших формах хвороби.
При важкому перебігу ГФМІ, особливо при інфекційно-токсичному шокові, протименінгококові антитіла виявляються в низьких титрах, в окремих випадках не виявляються зовсім. При дуже важкому перебігу хвороби, особливо при наявності важких ускладнень, антитілоутворення виражено слабо: у гострому періоді хвороби виявляються близько 10% серопозитивних проб з низькими титрами (1:5-1:10). Надалі, при поліпшенні стану хворих, титри антитіл та кількість серопозитивних проб може зростати.
Виявлення на першому тижні хвороби антитіл до полісахаридів менінгококів серогруп А і С у титрі 1:160 та вище підтверджує менінгококову етіологію захворювання. У деяких випадках такі титри антитіл можуть зберігатися і в пізніші терміни захворювання. У таких хворих, навіть коли не спостерігається сероконверсія, високі показники РНГА можуть служити достатньою підставою для підтвердження діагнозу ГФМІ.
Діагноз ГФМІ визначається як етіологічно підтверджений при наявності динаміки (4-кратного і більше) збільшення рівня антитіл. При двократному збільшенні титру антитіл діагноз оцінюється як підтверджений лише при вираженій клінічній картині захворювання.
Кількість етіологічно підтверджених випадків ГФМІ методом РНГА може досягати: у дорослих - 80%, у дітей - в середньому 70% (у віковій групі дітей 3 років - 60%, у старших вікових групах - 80%).
4.1.2. РНГА з діагностикумом серогрупи В
Інтерпретуючи дані серологічних досліджень, які одержано при роботі з діагностикумом на основі полісахариду менінгокока серогрупи В, потрібно враховувати такі моменти.
Полісахарид менінгокока серогрупи В - слабкий імуноген, його хімічна структура є ідентичною до полісахариду E. coli K1. Носійство менінгококів цієї серогрупи може досягати 50% і більше від числа серогрупованих штамів, виділених від здорових осіб, що може відбитись на високому фоновому рівні антитіл до полісахариду В серед населення (в 50% випадків можуть визначатися антитіла в титрах 1:80 та вище).
Генералізовані форми менінгококової інфекції, що обумовлені менінгококом серогрупи В, найчастіше (до 60%) виникають у дітей перших 3 років життя, у яких антитілоутворення виражено слабо. При ГФМІ у дорослих в більшості випадків, в перші дні хвороби рівень антитіл до менінгококу серогрупи В складає 1:20-1:40, з подальшою сероконверсією на 2-3-му тижнях. В окремих випадках (14%) наявність антитіл на 2-3-му тижнях може досягти титрів 1:640-1:1280 і вище.
Враховуючи широку циркуляцію менінгококів серогрупи В серед населення, визначити умовно-діагностичний титр антитіл до менінгококу цієї групи дуже складно. Серологічним підтвердженням клінічного діагнозу ГФМІ, викликаної менінгококами серогрупи В, можна визнавати збільшення рівня антитіл у дорослих від 1:160, у дітей - з 1:40 і вище.
4.1.3. Групова специфічність РНГА
При постановці РНГА з набором еритроцитарних діагностикумів може виявлятись одночасно присутність антитіл до декількох полісахаридів. У таких випадках серогрупи менінгококів визначають за динамікою збільшення рівня антитіл до одного із полісахаридів. При цьому різниця показників парних сироваток має бути не менш, ніж на 2 розведення. При отриманні однакових титрів антитіл до 2 полісахаридів в умовно-діагностичних титрах діагностуються ГФМІ без установлення серогрупи збудника.
4.2. РНГА при локалізованих формах менінгококової інфекції (назофарингіт і бактеріоносійство)
При локалізованих формах менінгококової інфекції серологічні дослідження не слід розглядати як метод діагностики, оскільки питання про носійство або наявність менінгококового назофарингіту вирішується на підставі бактеріологічного обстеження. Але у деяких випадках при проведенні досліджень в осередках ГФМІ серологічні дані можуть стати додатковим тестом, ретроспективно підтверджуючи клініко-епідеміологічний діагноз менінгококової інфекції. При цьому слід проводити обов'язкове дослідження парних зразків сироваток крові, отриманих з 10-14-добовим інтервалом.
При назофарингітах антитілоутворення вираженіше, ніж при бактеріоносійстві. У хворих на назофарингіт менінгококової етіології у 90% випадків виявляються протименінгококові антитіла, з них у 50% випадків - титри 1:40 і вище. Серед бактеріоносіїв, незалежно від серогрупи збудника, специфічні антитіла виявляються у 65% випадків, а з титрами 1:40 і вище - у 30% носіїв.
У сироватках крові, отриманих від носіїв, так як і від хворих, можуть виявлятися антитіла до декількох полісахаридів менінгококу. Збільшення антитіл до гомологічної серогрупи відзначають при носійстві менінгококу серогрупи А. В окремих випадках динаміка антитіл (сероконверсія) не дозволяє установити домінуючу серогрупу менінгококу. Тоді визнають носійство без установлення серогрупи.
4.3. РНГА при імуно-епідеміологічних дослідженнях
Метою імуно-епідеміологічних досліджень є визначення кількості осіб, сприйнятливих до менінгококової інфекції, та груп ризику. Аналіз здійснюють за кількістю серопозитивних та серонегативних осіб з урахуванням існуючої епідемічної ситуації. У період епідемічного неблагополуччя збільшується число серопозитивних осіб та відповідно зменшується число серонегативних до епідемічної серогрупи менінгококу. В період спорадичної захворюваності, навпаки, зростає кількість серонегативних осіб.
При проведенні імуно-епідеміологічних досліджень серед населення об'єм репрезентативних вибірок установлюється епідеміологом відповідно до кількості та вікового складу колективу, району, населеного пункту.
Визначений фоновий рівень протименінгококових антитіл пов'язаний з захворюваністю на менінгококову інфекцію на даній території і рівнем носійства. Найбільш високий рівень антитіл у різні епідеміологічні періоди визначають до менінгококів серогрупи В, що, можливо, відображає їх серологічну спорідненість з E. coli K1, моракселами, непатогенними нейсеріями. При цьому число серопозитивних проб з титрами антитіл 1:20 і вище може досягати 90%.
До менінгококів серогрупи С рівень антитіл менший, кількість серопозитивних сироваток крові з титром антитіл 1:20 і вище складає 8%.
Рівень антитіл до менінгококів серогрупи А дає досить чітку характеристику епідемічної ситуації і відображає широту циркуляції збудника.
Аналіз серологічних результатів епідеміологічних досліджень здійснюють на підставі розрахунку наступних показників:
а) відсотку серонегативних проб, отриманих з кожним із діагностикумів (A, B, C), який може відображати число сприйнятливих до менінгококової інфекції осіб;
б) відсотку серопозитивних проб (усі серопозитивні сироватки крові, розпочинаючи з розведення вище 1:5), із числа яких виділяють проби з титрами антитіл:
- у віковій групі до 3 років з 1:10 і вище до полісахаридів А і С, з 1:20 і вище - до полісахарида В;
- у старших вікових групах дітей і дорослих з 1:20 і вище до полісахаридів А і С, з 1:80 і вище - до полісахариду В. Відсоток сироваток крові з указаними вище рівнями антитіл відображає домінуючі на конкретній території серогрупи менінгококу.
4.4. Застосування РНГА для оцінки ефективності вакцинопрофілактики менінгококової інфекції
Формування поствакцинального імунітету носить групоспецифічний характер. У зв'язку з цим, в залежності від використаної для профілактики менінгококової вакцини, серологічне дослідження для оцінки ефективності вакцинації проводять, застосовуючи РНГА з гомологічним діагностикумом.
При вакцинації дорослих специфічні менінгококові антитіла до полісахариду А виявляють у високих титрах (1:40 - 1:640 і вище) не менше, ніж у 80% щеплених уже на 3-4-му тижні після вакцинації. Протягом наступних 6-8 місяців у щеплених титри антитіл у певній мірі знижуються, але зберігаються на підвищеному рівні більше 2 років.
