ЗАТВЕРДЖЕНО |
ІНСТРУКЦІЯ
з проведення лабораторної діагностики респіраторних захворювань та грипу, в тому числі з пандемічним потенціалом
1. Ця Інструкція поширюється на лабораторні центри та заклади охорони здоров’я незалежно від форм власності (далі - заклади).
2. Основними завданнями лабораторних центрів є моніторинг циркуляції вірусів грипу, в тому числі з пандемічним потенціалом:
виявлення генетичних змін чи появи реасортантів вірусів;
визначення стійкості вірусів до противірусних препаратів;
забезпечення специфічності та чутливості діагностичних методів, що використовуються в лабораторній практиці;
отримання необхідної інформації для розробки вакцин.
II. Біобезпека при проведенні лабораторних досліджень
1. Всі маніпуляції з відбору зразків від хворих, розкриття термоконтейнерів з пробами клінічного (секційного) матеріалу та дослідження медичний персонал проводить із використанням засобів індивідуального захисту:
респіратор № 95 (або одноразова маска);
захисні окуляри (захисний щиток).
2. Попередня підготовка проб та всі маніпуляції з клінічними зразками при дослідженні методом полімеразної ланцюгової реакції (далі - ПЛР) проводяться в умовах лабораторії другого або третього рівня біобезпеки залежно від епідемічної ситуації з використанням засобів індивідуального захисту.
3. Вірусологічні дослідження (зараження культур клітин або курячих ембріонів з метою ізоляції та ідентифікації вірусу), а також роботи, пов’язані з утворенням аерозолю вірусів грипу з пандемічним потенціалом, виконуються в умовах лабораторії з третім рівнем біобезпеки (BSL-3).
III. Заходи при проведенні дезінфекції
1. Всі предмети, що знаходилися в контакті з потенційно інфікованими матеріалами, підлягають знезараженню.
2. Знезараження поверхонь приміщень (підлога, стіни, двері), обладнання, робочих столів при лабораторній діагностиці захворювань, викликаних вірусами грипу, проводиться сучасними дезінфекційними засобами, що зареєстровані в Україні та мають віруліцидну активність відносно респіраторних вірусів і не впливають на хід дослідження.
3. Знезараження лабораторного посуду, наконечників, вірусовмісних рідин, агарозного гелю, інструментарію з металу, засобів індивідуального захисту одноразового використання та відпрацьованого матеріалу проводиться методом автоклавування (тиск 2,0 кгс/см3, температура 132 °С ± 2 °С протягом 45 хвилин). Знезараження дозаторів проводять двократним протиранням з інтервалом 15 хвилин 70-відсотковим етиловим спиртом або за інструкцією виробника.
IV. Правила відбору клінічного (секційного) матеріалу
1. Виявлення достовірного позитивного результату дослідження на грип та гострі респіраторні інфекції (далі - ГРІ) залежить від дотримання правил відбору зразків матеріалів, наведених у додатку 1 до цієї Інструкції, їх оперативної доставки до лабораторного центру і належного зберігання до проведення лабораторної діагностики.
2. Зразки клінічного матеріалу відбирають при зверненні пацієнта за медичною допомогою або його госпіталізації не пізніше 72 годин з часу появи симптомів захворювання до початку проведення антивірусної терапії.
3. Зразки матеріалів від осіб, померлих від грипу, ГРІ або з підозрою на неї, потрібно відбирати в межах 6-12 годин з часу біологічної смерті.
4. Відбір клінічного (секційного) матеріалу та його пакування проводять медичні працівники закладу стерильними інструментами в стерильні одноразові кріофлакони, пробірки, контейнери з гвинтовими кришками.
5. Працівники закладу обов’язково проходять навчання щодо правил дотримання біологічної безпеки при роботі з інфекційним матеріалом.
6. Лікар закладу під час огляду пацієнта визначає методи відбору зразків матеріалу для лабораторного дослідження:
3) мазок або аспірат із носоглотки;
4) аспірат фарингальний або бронхіальний;
5) зразки крові на початку захворювання та через 10-14 діб.
7. Відібрані мазки із зіва та носа допустимо об’єднувати в одну пробу та транспортувати в стерильних кріопробірках або кріофлаконах із використанням транспортного середовища.
8. Зразки матеріалів із дихальних шляхів для дослідження відбирають медичні працівники, при цьому використовуються такі матеріали:
1) засоби індивідуального захисту;
2) пластикові палички із стерильними тампонами з дакрону або віскози (дерев’яні палички з тампонами з альгінату кальцію або бавовни можуть містити речовини, що інактивують віруси та уповільнюють тестування в ПЛР, тому їх використовують лише за відсутності дакронових або віскозних тампонів), шпатель для язика (для взяття мазків із зіва), зразки яких наведено у додатку 2 до цієї Інструкції;
3) пластикові пробірки (кріопробірки, кріофлакони) місткістю 2-3 мл, що витримують температури в діапазоні від мінус 70 °C до мінус 180 °C (рідкий азот);
4) спиртостійкий маркер для маркування зразків.
V. Зберігання, пакування та транспортування відібраних зразків матеріалів
1. Відібрані зразки матеріалів зберігають у пластикових пробірках з транспортним середовищем при температурі 4 °C не більше 48 годин.
Для транспортування зразків матеріалів використовують 2-3 мл транспортного середовища (комерційного або приготовленого), розлитого в пластикові пробірки.
Склад транспортного середовища:
2 г бичачого альбуміну (фракція V);
0,8 мл розчину гентаміцину сульфату (50 мг/мл);
3,2 мл амфотерицину В (250 мкг/мл).
Довести до 400 мл стерильною дистильованою водою. Стерилізувати фільтрацією.
Виготовлене транспортне середовище зберігається в стерильних умовах без доступу світла при 4 °С - 8 °С протягом одного місяця або мінус 20 °С - протягом року.
2. За неможливості дослідити зразки матеріалів протягом 24-48 годин їх заморожують при температурі мінус 70 °C або у рідкому азоті. Секційний матеріал після відбору підлягає обов’язковому заморожуванню. Зразки матеріалів із дихальних шляхів у транспортному середовищі доставляють протягом 24-48 годин з часу відбору до лабораторного центру. Якщо неможливо своєчасно доставити до лабораторії, зразки матеріалів заморожують при температурі мінус 70 °C або в рідкому азоті та розморожують безпосередньо перед проведенням дослідження. Кожен зразок для довготривалого зберігання при температурі мінус 70 °C розділяється на аліквоти для додаткового, повторного тестування або архівації.
3. Кількість циклів заморожування/розморожування має бути мінімальною, оскільки це може зруйнувати вірус у зразку. Зразки матеріалів не слід зберігати у морозильній камері (мінус 20 °C) з циклом заморожування/розморожування; в такому випадку пробу можна тримати на льоду протягом тижня.
4. Зразки упаковуються згідно з вимогами до пакування P650 для інфекційних субстанцій UN 3373 категорії B. Транспортування зразків матеріалів здійснюється відповідно до правил поштових та кур’єрських перевезень.
Зразки матеріалів пакують у три прошарки:
перший - кріопробірка (кріофлакон із гвинтовою кришкою);
другий - контейнер, що не пропускає рідину (пакет із застібкою, контейнер із пластика);
третій - тверде зовнішнє пакування (сумка-холодильник).
Між кріопробіркою (кріофлаконом) та другим водонепроникним шаром розміщують абсорбуючий матеріал, достатній для абсорбції всього об’єму рідких зразків матеріалів.
VI. Діагностика грипу та інших ГРІ методом ПЛР
Для індикації вірусів грипу та ГРІ проводять дослідження зразків матеріалів методом ПЛР згідно з інструкцією виробника тест-систем.
Результати дослідження інтерпретують із урахуванням клінічних та епідеміологічних даних.
VII. Вірусологічне дослідження грипу та інших ГРІ
Виділення та культивування вірусів грипу на культурі клітин Madin-Darby canine kidney (далі - MDCK):
з метою ізоляції вірусів грипу із зразків матеріалів від пацієнтів з підозрою на грип використовують культуру клітин MDCK;
ведення культури клітин MDCK розпочинають з приготування інгредієнтів: середовища росту, підтримувального середовища, розчину трипсину згідно з додатком 3 до цієї Інструкції;
проведення інфікування культури клітин MDCК клінічним матеріалом від пацієнтів з підозрою на грип або інші респіраторні вірусні інфекції або 10-11-денних курячих ембріонів;
інфіковані клітини MDCК на середовищі для підтримання росту поміщають в термостат для накопичення вірусу на 5-7 діб із щоденною мікроскопією культури клітин для виявлення цитопатичної дії вірусу (далі - ЦПД);
за необхідності ізоляцію вірусів грипу проводять на курячих ембріонах паралельно з інфікуванням клітин MDCК;
визначення наявності вірусу грипу в амніотичній, алантоїсній або культуральній рідинах проводять у реакції гемаглютинації (далі - РГА);
типування вірусу грипу проводять у реакції гальмування гемаглютинації (далі - РГГА), для чого відбирають у стерильні пробірки алантоїсну (амніотичну) рідину, тестують з грипозними діагностичними сироватками згідно з інструкцією виробника;
додатковий метод підтвердження наявності вірусу грипу в ізоляті - імунохроматографія (далі - ІХА).
VIII. Методи серологічного дослідження грипу та інших ГРІ
Серологічна діагностика ґрунтується на виявленні приросту антитіл в парних сироватках пацієнтів. З цією метою застосовують РГГА або визначають наявність антитіл різних класів методом імуноферментного аналізу (далі - ІФА).
приготування робочої дози вірусу;
приготування суспензії еритроцитів;
З грипозними антигенами для проведення РГГА використовують 1 % суспензію еритроцитів курей чи людини 0 (І) групи та комерційні діагностикуми грипозних антигенів із штамів вірусів грипу.
Перед постановкою реакції парні сироватки від пацієнтів розводять в 10 разів фізіологічним розчином (далі - ФР) і прогрівають на водяній бані при температурі 56 °C протягом 30 хвилин. Готують робочу дозу вірусу, суспензії еритроцитів та проводять реакцію.
У разі використання парагрипозних антигенів при постановці РГГА для вилучення неспецифічних інгібіторів сироватки обробляють еритроцитами морської свинки та коаліном. Для цього сироватку змішують з 10 % суспензією еритроцитів морської свинки у співвідношенні 1:5. Після 30-хвилинної інкубації при температурі 4 °C суміш центрифугують і до надосадової рідини додають рівний об'єм 25 % розчину каоліну на ФР. Суміш активно струшують в шутелі 20 хвилин, а потім центрифугують 10 хвилин при 2000 об/хв. Надосадова рідина - це сироватка в розведенні 1:10. В реакції використовують 0,5 % суспензію еритроцитів морської свинки.
Діагностикум розводять до вмісту 4 аглютинуючих одиниць (далі - АО) вірусу у робочій дозі. Постановку реакції проводять згідно з інструкцією виробника.
Діагностично достовірним є чотирикратне збільшення титрів антитіл у сироватці, отриманій на 10-14 день, порівняно із сироваткою, взятою на початку захворювання.
IX. Метод імунофлуоресцентної діагностики і аналізу грипу та інших ГРІ
1. Метод імунофлуоресцентних антитіл (далі - МФА) використовують для швидкої діагностики грипу, парагрипу, адено-, РС-вірусної інфекції та мікоплазми пневмонії, а також змішаних інфекцій. В основі методу лежить здатність антигенів вступати в реакцію зі специфічними противірусними антитілами, міченими флуорохромом. Етіологічний діагноз встановлюють за допомогою МФА через 3-4 години при дослідженні препаратів від пацієнтів і через 24-48 годин при зараженні культури клітин. Ефективність досліджень найвища в гострій фазі захворювання і суттєво залежить від якості відбору зразків матеріалів та приготування препаратів.
2. Діагностика здійснюється у двох напрямах:
1) виявлення вірусного антигену в клітинах циліндричного епітелію слизової оболонки носоглотки або у відбитках із секційного матеріалу;
2) виявлення вірусного антигену в культурах клітин, інфікованих матеріалом від пацієнтів.
3. Використовують прямий і непрямий методи імунофлуоресценції:
1) при прямій модифікації методу використовують комерційні флуоресцентні глобуліни проти вірусів грипу, парагрипу, аденовірусів, РС-вірусів та інших;
2) для непрямого методу використовують противірусні імунні сироватки різних видів тварин і відповідні антивидові флуоресцентні глобуліни.
4. Фарбування препаратів та оцінка результатів проводяться згідно з інструкцією виробника щодо флуоресцентних діагностичних імуноглобулінів.
X. Виділення та ідентифікація інших респіраторних вірусів
Наявність збудників респіраторних інфекцій, фрагментів нуклеїнових кислот та їх антигенів у зразках матеріалів від пацієнтів із підозрою на грип та ГРВІ визначають згідно з додатком 4 до цієї Інструкції такими методами:
Специфічні антитіла визначають у реакції РЗК, ІФА, реакції нейтралізації.
Додаток 1 |
I. Механізм відбору зразків матеріалів
1. При відборі мазків із носа та зіва обов’язкове дотримання правил безпеки (гігієна рук, засоби індивідуального захисту тощо).
2. Під час відбору паличку з тампоном затискають між великим, вказівним та середнім пальцями так, щоб паличка проходила наче олівець (мал. 1), а не впиралася у долоню (мал. 2). Це необхідно для забезпечення безпеки пацієнта: у першому випадку паличка проковзне в безпечному напрямку, в другому - рух палички буде обмежений, тому пацієнт може травмуватися.
Мал. 1. Паличка з тампоном взята правильно
Мал. 2. Паличка з тампоном взята неправильно
1. Метод взяття мазків із задньої стінки глотки (мазки із зіва):
взяти тампон і повільним рухом зробити мазок із задньої стінки глотки та мигдаликів (мал. 3);
попросити пацієнта розкрити рота, щоб піднявся язичок на піднебінні (вимовити протяжний голосний звук);
язик утримувати за допомогою шпателя;
відбір мазків проводити, не торкаючись тампоном м’якого піднебіння;
помістити тампон у стерильну пробірку з 2-3 мл транспортного середовища;
відламати паличку тампона так, щоб кінець його залишився у пробірці, а кришечка закрилася. Якщо пластикова паличка не ламається, її відрізають ножицями (охолодженими після стерилізації на вогні);
зазначити в етикетці індивідуальний номер, дату відбору зразка, тип зразка в пробірці (мазок із зіва, назальний тощо) та наклеїти на контейнер із зразком, кришечку не маркувати.
2. Метод взяття переднього назального мазка:
ввести кінчик тампона в ніздрю на 2-3 см від носового отвору, торкаючись передньої носової раковини і слизової оболонки перегородки, повертаючи тампон, щоб зібрати назальні слизові виділення (мал. 4);
тампон вводити в ніздрю паралельно піднебінню;
абсорбувати виділення, зразки з обох ніздрів брати одним тампоном;
помістити тампон у стерильну пробірку з 2-3 мл транспортного середовища разом із мазком із зіва;
відламати паличку тампона так, щоб кінець його залишився у пробірці, а кришечка закрилася.
3. Метод відбору фарингального аспірату:
секрет носоглотки аспірувати вакуумним відсмоктувачем та катетером, що приєднаний до флакона для відбору матеріалу;
катетер вводити в ніздрю паралельно піднебінню (мал. 5);
провести вакуумну аспірацію, під час якої катетер виймати повільно за допомогою обертового руху. Слиз із другої ніздрі збирати тим самим катетером;
зразок матеріалу помістити у стерильну пробірку з 2-3 мл транспортного середовища.
У разі дослідження методом ПЛР зразок матеріалу поміщають в стерильну одноразову пробірку, що не містить дезоксирибонуклеази та рибонуклеази, щільно закривають кришку пробірки.
Мал. 5. Взяття фарингального аспірату
4. Метод відбору секційного матеріалу:
для дослідження відібрати 3-4 зразки матеріалів легень, трахеї, сегментарних бронхів з ознаками патоморфологічних змін об’ємом 1 см3 ;
зразки матеріалів помістити в одноразові стерильні поліпропіленові кріофлакони з гвинтовими кришками, що щільно закриваються;
зразки транспортувати замороженими згідно з Інструкцією з проведення лабораторної діагностики респіраторних захворювань та грипу, в тому числі з пандемічним потенціалом, затвердженою наказом МОЗ України від 06 листопада 2015 року № 732;
для мінімізації інфікування персоналу застосовувати біопсійну голку (мал. 6);
Мал. 6. Біопсійна голка для відбору зразків секційних матеріалів
відбір зразка матеріалу здійснювати з ділянки легені, де рентгенологічно визначено ознаки пневмонії. Для контролю відібрати 1 біоптат із неураженої ділянки. Відбирають мінімум 4 зразки з глибокого шару тканин з ознаками пневмонії, за наявності рідкого азоту - 5 зразків.
Додаток 2 |
ЗРАЗКИ
матеріалів для дослідження дихальних шляхів
Мал. 2. Зразок шпателя для забору матеріалу із зіва
Додаток 3 |
І. Ведення культури клітин МDСК
Для роботи з культурою клітин МDСК готують такі інгредієнти:
до 500 мл середовища Ігла в модифікації Дальбекко, каталожний номер 1033220 (далі - DMEM), додають:
50 мл телячої ембріональної сироватки (далі - ТЕС);
5,5 мл П/С (пеніцилін/стрептоміцин).
Розчин зберігають при +4 °С протягом 2 тижнів;
До 100 мл дистильованої води додають 200 мг трипсину фірми Sigma, каталожний номер Т-1426 (2 мг/мл = 0,2 % вага/об'єм). Фільтрують розчин через 0,1 мкм мембранний фільтр. Розливають по 1 мл в пробірки із щільно підігнаними пробками.
Строк використання - 2 роки від дати приготування. Зберігають замороженим при мінус 20 °С;
розчин Хенкса з трипсином (для промивання):
до 300 мл розчину Хенкса додають приготовленого 0,15 мл розчину трипсину (2 мкг/мл кінцева концентрація).
Розчин придатний протягом доби;
підтримувальне середовище DMEM із трипсином:
до 500 мл середовища DMEM додають:
5,4 мл глютаміну (кінцева концентрація 2 ммоль);
5,4 мл П/С (пеніцилін/стрептоміцин);
13,5 мл ТСА (телячий сироватковий альбумін);
13,5 мл 1 М буферний сольовий розчин з рН 7,2, каталожний номер 194550 (далі - НЕРЕS).
Строк використання - 1 тиждень, зберігають при температурі 4 °С.
У день зараження клітин до 100 мл підтримувального середовища додають 0,2 мл розчину трипсину (2 мкг/мл кінцева концентрація). Розчин придатний протягом доби.
ІІ. Культивування та субкультивування культури клітин MDCК
Клітинна культура MDCК зберігає високу чутливість до вірусів грипу типів А та В протягом 20 пасажів. Після 21 пасажу вигляд культури змінюється (набуває вигляду павутини), щільного моношару отримати неможливо. Це ускладнює виявлення цитопатичної дії (далі - ЦПД), тому оптимально використовувати культуру клітин MDCК включно до 20 пасажу.
Культивування проводять при температурі в камері термостата 35 °С - 37 °С.
Із матраца з моношаром клітин MDCК видаляють ростове середовище. Клітини MDCК відмивають невеликим об'ємом теплого розчину (трипсин ЕDТА або 1 флакон хімопсину + 500 мл розчину версену).
Клітинний моношар відмивають, легко погойдуючи протягом 1 хвилини, після чого видаляють розчин. Процедуру повторюють, після цього вносять вказані розчини до покриття моношару клітин і поміщають в термостат при температурі 37 °С. Контроль відторгнення клітин проводять протягом 30 хвилин до повного їх сповзання, фіксуючи результат шляхом мікроскопії. Для прискорення відторгнення клітин допускається постукування рукою по стінці матраца.
Для припинення дії ферментів у матрац вносять невеликий об’єм рівних частин телячої ембріональної сироватки та основного середовища. Суспензію клітин легко піпетують та проводять підрахунок клітин в камері Горяєва.
Залежно від терміну інфікування культур клітин готують такі концентрації клітин:
100 000 кл/мл - 72 години інкубації;
200 000 кл/мл - 48 годин інкубації;
400 000 кл/мл - 24 години інкубації.
Вихідну суспензію клітин розводять до потрібної концентрації ростовим середовищем, розливають у матраци або флакони (пробірки) і поміщають в термостат при температурі 37 °С для росту моношару.
ІІІ. Інфікування культури клітин MDCК клінічним матеріалом, накопичення та ізоляція вірусу на курячих ембріонах
Для збільшення концентрації вірусів у зразках матеріалів проводять обробку зразків ультразвуком (30 секунд при 12 кГц) або заморожують при мінус 70 °С або в рідкому азоті з наступним розморожуванням.
Зразок деконтамінують, додаючи розчин антибіотика (гентаміцин 4 % тощо із розрахунку гентаміціну 10 мг/мл, тобто до 2 мл змиву додають 0,2 мл гентаміцину 4 %).
При первинному зараженні використовують пробірки (флакони) з моношаром клітин MDCК.
Із пробірок (флаконів) видаляють ростове середовище, тричі відмивають клітини 1,0 мл розчином Хенкса з трипсином. Середовище видаляють, у моношар 2-3 пробірок (флаконів) вносять по 0,2 мл змиву матеріалу від пацієнта.
Інкубують 30-60 хвилин при температурі 34 °С. Потім до всіх флаконів вносять по 1 мл підтримувального середовища з доданим трипсином, інкубують 5-7 діб при 34 °С в термостаті (бажано з подачею 5 % СО2), контролюючи кожного дня стан моношару.
На 2-4 добу проводиться контроль постановкою РГА з 0,75 % суспензією еритроцитів людини 0 групи крові або пташиних еритроцитів. Стерильно відбирають по 50 мкл культуральної рідини для контролю наявності вірусу та титрують при підозрі на наявність вірусу в пробі.
При вираженій ЦПД і позитивній РГА проба вважається позитивною. Між пасажами проби зберігають при температурі мінус 70 °С і нижче. За відсутності низькотемпературних холодильників проби зберігають 1-2 дні в холодильнику при температурі 4 °С.
За відсутності вираженої ЦПД та при негативному результаті РГА проби витримують до 12 днів, потім заморожують з наступним розмороженням. При негативному результаті проводять додатковий пасаж (1 пасаж). Виконують зазвичай до 3 пасажів, після чого проба вважається негативною.
У разі різниці виявлення РНК вірусу грипу методом ПЛР у первинному матеріалі та відсутності позитивної реакції РГА або РГГА емпірично підбирають еритроцити (курки, індички, гвінейської свинки, 0 (І) групи крові людини тощо).
Схема підбору еритроцитів для РГА або РГГА
Накопичення вірусів проводять в культуральних матрацах або флаконах з моношаром клітин MDCК площиною 25 см2 (і більше).
Перед зараженням моношар клітин відмивають двічі основним середовищем в об'ємі 5 мл, а потім вносять вірусовмісну рідину в об'ємі 0,5 мл (ступінь розведення вірусу залежить від вихідного титру. Титр вірусу після первинного зараження 1:2 можна використовувати без розведення, а титр 1:32 - з розведенням 1:10 і вище).
Обережно розміщують вірусовмісну рідину на поверхні моношару клітин, ставлять на інкубацію при 34 °С на 30-60 хвилин, періодично погойдуючи матраци. Після закінчення інкубації додають підтримувальне середовище в об'ємі 10-12 мл та ставлять в термостат при 34 °С. Щодня мікроскопують стан клітинного моношару. При вираженому ЦПД (розрив моношару, закруглення, сповзання клітин) клітини переносять в центрифужні пробірки та центрифугують при 1500-2000 об/хв 10-15 хвилин. Відбирають супернатант у стерильні пробірки і використовують для типування в реакції РГГА з грипозними діагностичними сироватками згідно з інструкцією виробника.
VІ. Ізоляція вірусів грипу на курячих ембріонах
Ізоляти вірусів у високому титрі отримують при їх ізоляції на курячих ембріонах.
В амніотичну та алантоїсну порожнини курячих ембріонів 10-11-денного віку вводять зразки матеріалів по 0,1 мл. Одним зразком заражають 3 ембріони.
Залишок зразків матеріалів використовують для засіву на стерильність (середовище 199 без антибіотиків, бульйон тощо).
Заражені ембріони інкубують в термостаті при температурі 33 °С - 34 °C 72 години, після чого охолоджують протягом 16 годин при температурі 4 °C або 30 хвилин при мінус 20 °C. Після охолодження пастерівською піпеткою відбирають в стерильні пробірки рідину з амніотичної та алантоїсної порожнини і перевіряють її на вміст вірусу грипу в РГА.
РГА ставлять з використанням 1 % суспензії еритроцитів морської свинки (або людини 0 групи), які чутливі для виявлення вірусу при ранніх пасажах. Для збільшення титру вірусу до рівня, що може визначитися в РГА, додатково роблять 2-3 "сліпих" пасажі.
Зібрану рідину, що містить вірус, освітлюють центрифугуванням 10 хвилин при 10 тисячах обертів і зберігають надосад при температурі 4 °C до наступного зараження курячих ембріонів. Якщо алантоїсна рідина містить вірус, перед інокуляцією її розводять розчином Хенкса або забуференим фізрозчином до концентрації вірусу 10-100 ГАО/мл.
Відбирають алантоїсну (амніотичну) рідину, що містить вірус, у стерильні пробірки і використовують для типування в РГГА з грипозними діагностичними сироватками згідно з інструкцією виробника.
Додаток 4 |
Виділення
та ідентифікація інших респіраторних вірусів
Відбір зразків матеріалів для виділення респіраторних вірусів, зокрема аденовірусів, здійснюють на 1-7 день з початку захворювання. Матеріалом для досліджень служать мазки та змиви з носа, горла, кон’юнктиви та секційний матеріал.
В лабораторії зразки матеріалів зберігаються при мінус 20 °C до 7 днів, при більшому терміні зберігання - при мінус 70 °C.
Матеріалом заражають по 3-4 пробірочних культури HELA або HEP-2 та інкубують протягом 5-6 годин, після чого в пробірки додають підтримувальне середовище (середовище 199 з 5 % ембріональною сироваткою телят або 5 % лактальбуміну).
Для аденовірусів характерна епітеліотропність, специфічний тип дегенерації клітин культури і швидке підкислення середовища. За необхідності пасування культуральну рідину зливають, клітинний шар механічно руйнують, клітини разом із залишками середовища об’єднують в одну пробірку. Потім пробірки тричі швидко заморожують з наступним розморожуванням, центрифугують і надосад використовують для пасажу. За наявності характерної дегенерації клітин вміст пробірок об’єднують, двічі заморожують, розморожують та інфікують культуру клітин як нерозведеним вірусом, так і розведеним від 10 з відхиленням в 1 логарифм (по 4 пробірки). Ідентифікацію цитопатогенного агента з аденовірусами проводять також за допомогою реакції зв’язування комплементу (далі - РЗК) згідно з інструкцією.
Для підтвердження діагнозу проводять реакцію нейтралізації цитопатогенної активності вірусу парними сироватками хворого, відібраними на початку захворювання та після 2-4 тижнів. Сироватки попередньо звільняють від неспецифічних інгібіторів. Антиген в дозі 100 ТЦД 50/0,2 мл змішують з рівними об’ємами розведень першої і другої сироваток, інкубують 1 годину при 37 °C і суміш антигену з антитілами по 0,2 мл інокулюють в культури клітин.
Для контролю використовують дози вірусу та сироваток, незаражені культури тканини. Якщо виділений агент викликав захворювання, титр віруснейтралізуючих антитіл другої сироватки вище в 4 і більше разів ніж першої.
Респіраторно-синцитіальний вірус (далі - РС-вірус) відрізняється надзвичайною лабільністю і низьким титром в секретах пацієнта, що практично робить неможливим його ізоляцію з проб, що довго зберігалися.
У зв’язку з цим зразки матеріалів доставляють в умовах «холодового ланцюга» у вірусологічну лабораторію на пізніше 2 годин або проводять інфікування чутливої культури клітин (лінії HEP-2, HELA) біля ліжка хворого. Не допускається заморожування. Інокуляцію чутливих культур клітин здійснюють у перші години після відбору матеріалу.
Заражену культуру інкубують при 37 °C не менше 3 тижнів, регулярно змінюючи середовище. ЦПД має вигляд синцитію, що спостерігається не завжди та визначається багатьма факторами, в тому числі штамом вірусу, умовами культивування, типом клітин. Обробка клітин або проби ДЕАЕ-декстраном підвищує чутливість клітин до РС-вірусу. Кількість клітин, заражених РС-вірусом людини, може збільшуватись в 100 разів при додаванні 15 мгк/мл ДЕАЕ-декстрану. В присутності високих концентрацій (близько 40 %) сахарози інфекційність РС-вірусу стабілізується.
В культуральній рідині інфікованих клітин гемаглютинін РС-вірусу не виявляється.
Індикація персистентного РС-вірусу в інфікованих клітинах здійснюється за допомогою МФА або ІФА. За наявності дегенерації 75 % клітинного шару в культурах клітин в культуральній рідині визначають антиген РС-вірусу в РЗК з антитілами до еталонного штаму РС-вірусу.
Реакцію нейтралізації для типування виділених РС-вірусів ставлять за загальноприйнятою методикою з використанням імунних сироваток морських свинок.
Для виділення парагрипозних вірусів (далі - ПГВ) використовують первинні культури клітин нирок мавпи, морської свинки, ембріонів людини та перещеплювані культури клітин HЕР-2, Vero, ВНК-21. Культивування інфікованих культур клітин проводять при температурі 35 °C 14-20 діб. Розмноження вірусу в культурі клітин визначають за цитопатичною дією (багатоядерні симпласти, заокруглення клітин, культура у вигляді швейцарського сиру) та за реакцією гальмування гемадсорбції (далі - РГА) із 0,5 % зависсю еритроцитів морської свинки.
Ідентифікація виділених штамів проводиться в реакціях нейтралізації імунними сироватками в культурах клітин, РГА та РГГА.
РГА ставлять з 0,2 мл 0,4 % суспензії стерильних еритроцитів морської свинки, що вносять у заражені і контрольні пробірки без попереднього вилучення підтримувального середовища. Штатив з пробами витримують клітинним моношаром вниз при 4 °C 30-40 хвилин. Гемадсорбція спостерігається не раніше 4-5 днів після зараження культури клітин.
При негативних результатах (особливо в першому пасажі) пробірки з культурою клітин витримують в термостаті до 20 днів, РГА ставлять через кожні 5 днів. Після другої реакції проводять часткову заміну середовища.
Ідентифікацію вірусів ПГВ здійснюють шляхом постановки РГГА або в реакції нейтралізації (далі - РН).
РГГА ставиться на 15 пробірках HЕР-2, до яких вносять по 0,2 мл матеріалу, що дав у попередньому пасажі позитивну гемадсорбцію. Підтримувальне середовище - середовище 199 без сироватки, інкубація - при 37 °C. На 5 день зливають середовище, відмивають клітини розчином Хенкса і вносять в кожні 3 пробірки по 0,2 мл гіперімунної кролячої сироватки до 1, 2; 3 і 4 типів ПГВ в розведенні 1:10, а потім додають по 0,6 мл розчину Хенкса. Контакт 20 хвилин при 20 °C, після чого в усі пробірки додають по 0,2 мл 0,4 % суспензії еритроцитів морської свинки і ставлять культуру на 30 хвилин при 4 °C. Гемадсорбція відсутня в контролях культури і в тих пробірках, де тип вірусу збігся з типом однієї із гіперімунних сироваток.
Постановку РН ПГВ ставлять із 100 гемадсорбуючими одиницями в об’ємі 0,2 мл. Цю дозу з’єднують з 0,2 мл специфічної імунної сироватки кожного типу в розведенні 1:10-1:20 (з титром антитіл 1:80-1:160). Після 2-годинного контакту при 20 °C в пробірки з культурою клітин вносять по 0,2 мл суміші антигену з антитілом, додають середовище 199 та інкубують при 37 °C. Для кожного типу сироватки беруть по три пробірки. Ставлять контроль вірусу.
Через 4-5 днів в усі пробірки вносять по 0,2 мл суспензії еритроцитів і реєструють наявність або відсутність гемадсорбції. Ідентичність виділеного вірусу з’ясовують по наявності позитивної реакції гемадсорбції в контролях вірусу та її відсутності в контролях культури і в пробірках, куди були внесені суміші вірусу і сироватки певного типу.
Прискорену ідентифікацію віділеного в культурі клітин вірусу проводять методом імунофлуоресцентного аналізу (далі - МФА) та методом імуноферментного аналізу (далі - ІФА).
Серологічну діагностику проводять, досліджуючи парні сироватки у РГГА, РЗК з еталонними штамами ПГВ.
Дослідження МФА використовують для швидкої діагностики грипу, парагрипу, адено-, РС-вірусної інфекції та мікоплазми пневмонії, а також змішаних інфекцій.
З допомогою МФА етіологічний діагноз встановлюють через 2-3 години при дослідженні зразків матеріалу від пацієнтів і через 24-48 годин - при зараженні культури клітин. Ефективність досліджень найвища в перші 3 дні захворювання. Техніку дослідження та оцінку результатів МФА проводять згідно з інструкцією виробника діагностичних препаратів.
Серологічна діагностика ґрунтується на виявленні приросту антитіл в парних сироватках пацієнтів (РГГА) реакцією зв’язування комплементу, реакцією пасивної гемаглютинації, реакцією радіального гемолізу. При виявленні антитіл класів Ig M та G у сироватці крові пацієнтів дослідження проводять методом ІФА. Враховуючи достатню інформативність цих методів, вони широко використовуються в епідеміологічному аналізі: визначення рівня колективного гуморального імунітету, ретроспективний аналіз природи епідемічних спалахів, оцінка імуногенної активності грипозних вакцин.
Для проведення серологічних реакцій як антигени використовують стандартні діагностикуми.
